एंट हार्पेग्नाथोस साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के लिए भ्रूण इंजेक्शन
Summary
कीट सामाजिकता की कई विशेषताएं कॉलोनी के भीतर संचार और श्रम के विभाजन पर निर्भर करती हैं। माइक्रोइंजेक्शन और सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के माध्यम से चींटी भ्रूण में प्रमुख नियामक जीन का आनुवंशिक हेरफेर यूसोशल कीड़ों में परोपकारी व्यवहार की प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
Abstract
यूसोशल कीटों के अद्वितीय लक्षण, जैसे कि सामाजिक व्यवहार और श्रम का प्रजनन विभाजन, उनकी आनुवंशिक प्रणाली द्वारा नियंत्रित होते हैं। यह पता लगाने के लिए कि जीन सामाजिक लक्षणों को कैसे नियंत्रित करते हैं, हमने अपने समकालिक चरण के दौरान युवा भ्रूण में सीआरआईएसपीआर कॉम्प्लेक्स के वितरण के माध्यम से उत्परिवर्ती चींटियों को विकसित किया है। यहां, हम हार्पेग्नाथोस साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस का एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो एक पोनेरिन चींटी प्रजाति है जो हड़ताली फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करती है। एच साल्टेटर चींटियों को प्रयोगशाला सेटिंग में आसानी से पाला जाता है। भ्रूण को कैस 9 प्रोटीन के साथ माइक्रोइंजेक्शन के लिए एकत्र किया जाता है और इन विट्रो संश्लेषित छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को घर-निर्मित क्वार्ट्ज सुइयों का उपयोग करके एकत्र किया जाता है। पोस्ट-इंजेक्शन भ्रूण कॉलोनी के बाहर पाले जाते हैं। पहले लार्वा के उद्भव के बाद, सभी भ्रूण और लार्वा को आगे के विकास के लिए कुछ नर्सिंग श्रमिकों के साथ घोंसले के बॉक्स में ले जाया जाता है। यह प्रोटोकॉल चींटियों में जाति-विशिष्ट शरीर विज्ञान और सामाजिक व्यवहार के विश्लेषण के लिए म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन हाइमनोप्टेरान और अन्य कीड़ों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
कीटों में यूसोशलिटी का विकास, अर्थात् हाइमनोप्टेरा और ब्लाटोडिया (पूर्व में आइसोप्टेरा) के आदेशों के परिणामस्वरूप अद्वितीय और अक्सर परिष्कृत व्यवहार लक्षण सामने आए हैं जो व्यक्तिगत और कॉलोनी दोनों स्तरों पर प्रकट होते हैं। श्रम का प्रजनन विभाजन, सामाजिक कीटों के सबसे उन्नत समूहों की विशेषता वाला एक लक्षण, अक्सर कई व्यवहारिक और अक्सर रूपात्मक रूप से विशिष्ट समूहों से बना जाति प्रणालियां शामिल होती हैं। जातियों के बीच इस तरह की व्यवहार और रूपात्मक विविधता न केवल उनकी आनुवंशिक प्रणाली द्वारा नियंत्रित की जाती है, बल्कि अक्सर पर्यावरण 1,2,3,4 द्वारा भी नियंत्रित होती है, जिससे यूसोशल कीड़े आनुवंशिक और एपिजेनेटिक अनुसंधान के लिए आकर्षक विषय बन जाते हैं।
यूसोशल कीटों की आनुवंशिक प्रणाली में हेरफेर करने की क्षमता चुनौतीपूर्ण साबित हुई है क्योंकि कई प्रजातियां प्रयोगशाला सेटिंग्स में संभोग और प्रजनन नहीं करती हैं। अधिकांश यूसोशल कीटों में एक कॉलोनी में बहुत कम प्रजनन व्यक्ति होते हैं, जो पैदा होने वाली संतानों की संख्या को सीमित करते हैं और परिणामस्वरूप, आनुवंशिक हेरफेर के लिए नमूना आकार को सीमित करतेहैं। इसके अतिरिक्त, कई यूसोशल कीटों में आमतौर पर आनुवंशिक अध्ययन (जैसे ड्रोसोफिला) के लिए उपयोग किए जाने वाले कीड़ों की तुलना में लंबी पीढ़ी का समय होता है, जिससे आनुवंशिक लाइनों को स्थापित करने में कठिनाई होतीहै। हालांकि, कुछ यूसोशल प्रजातियां एक कॉलोनी में प्रजनन रूप से सक्रिय व्यक्तियों का एक बड़ा अनुपात उत्पन्न कर सकती हैं, जो चुनौतियों को कम करती हैं और उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक लाइनों को स्थापित करने के अवसर प्रदान करती हैं।
पोनेरिन चींटी प्रजाति, हार्पेग्नाथोस साल्टेटर के मामले में, सभी महिला श्रमिक रानी की मृत्यु या सामाजिक अलगाव पर प्रजनन रूप से सक्रिय हो सकती हैं। इन श्रमिकों को “गेमरगेट्स” के रूप में जाना जाता है और इसका उपयोग नई कॉलोनियों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकताहै। इसके अलावा, एक कॉलोनी में एक से अधिक गेमरगेट मौजूद हो सकते हैं, इस प्रकार संतान उत्पादन 5,7,8 बढ़ सकता है। अब तक, उत्परिवर्ती और / या ट्रांसजेनिक लाइनें यूरोपीय मधुमक्खी, एपिस मेलिफेरा, और चींटी प्रजातियों में विकसित की गई हैं, एच साल्टेटर, ओसेरिया बिरोई, और सोलेनोसिस इनविक्टा 9,10,11,12,13,14,15 . सामाजिक मधुमक्खियों और चींटियों में आनुवंशिक विश्लेषण ने यूसोशलिटी की बेहतर समझ की ओर मार्ग प्रशस्त किया है, जो जीन और यूसोशल कीट व्यवहार और जाति-विशिष्ट शरीर विज्ञान पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के अवसरों की एक सरणी प्रदान करता है।
यहां, हम एच साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली के माध्यम से आनुवंशिक संशोधन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, इस तकनीक का उपयोग ऑर्को में जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जीन सभी ओडोरेंट रिसेप्टर्स (ओआरएस) 10 के सह-रिसेप्टर को एन्कोडिंग करता है। हाइमनोप्टेरान यूसोशल कीड़ों16 में जीन का उल्लेखनीय रूप से विस्तार किया गया है, और ऑर्को कीट ओलफैक्शन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है; इसकी अनुपस्थिति में, ओआर सामान्य रूप से इकट्ठा या कार्य नहीं करते हैं। इसलिए ऑर्को जीन के उत्परिवर्तन घ्राण संवेदना, तंत्रिका विकास और संबंधित सामाजिक व्यवहार 9,10 को बाधित करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, कैस 9 प्रोटीन और छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को एक लक्ष्य जीन के म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के उद्देश्य से माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके चींटी भ्रूण में पेश किया जाता है। यहां, हम कॉलोनियों और इंजेक्शन भ्रूण की देखभाल के बारे में निर्देशों के साथ माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करेंगे। ये विधियां एच साल्टेटर चींटियों में विभिन्न जीनों में म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त हैं और हाइमनोप्टेरान कीटों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू की जा सकती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
चींटियों, मधुमक्खियों, ततैया और दीमकों सहित कीड़ों के बीच यूसोशलिटी के विकास के परिणामस्वरूप नए व्यवहार और रूपात्मक लक्षण दिखाई दिए हैं, जिनमें से कई को पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों 1,2,3,4<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय में डैनी रेनबर्ग और क्लाउड डेसप्लान की प्रयोगशालाओं और एरिजोना स्टेट यूनिवर्सिटी में जुरगेन लिबिग की प्रयोगशाला को चींटी आनुवंशिकी पर उनके समर्थन के लिए धन्यवाद दिया। हुआ यान ने अनुदान संख्या आईआईपी -1821914 के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन आई / यूसीआरसी, आर्थ्रोपोड मैनेजमेंट टेक्नोलॉजीज सेंटर और उद्योग भागीदारों से समर्थन स्वीकार किया। माया सार को संयुक्त राज्य अमेरिका – इज़राइल द्विराष्ट्रीय कृषि अनुसंधान और विकास कोष, वाडिया-बार्ड पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप नंबर एफआई -595-19 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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