개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사
Summary
곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.
Abstract
사회적 행동 및 생식 분업과 같은 진사회적 곤충의 독특한 특성은 유전 시스템에 의해 제어됩니다. 유전자가 사회적 형질을 조절하는 방법을 다루기 위해 우리는 CRISPR 복합체를 세포 융합 단계에서 어린 배아에 전달하여 돌연변이 개미를 개발했습니다. 여기에서 우리는 현저한 표현형 가소성을 나타내는 포네린 개미 종인 Harpegnathos saltator에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. H. 소금 개미는 실험실 환경에서 쉽게 사육됩니다. 배아는 Cas9 단백질로 미세 주입하기 위해 수집되고 집에서 만든 석영 바늘을 사용하여 시험관 내에서 합성 된 작은 가이드 RNA (sgRNA)가 수집됩니다. 주입 후 배아는 식민지 외부에서 사육됩니다. 첫 번째 유충이 출현 한 후, 모든 배아와 유충은 추가 개발을 위해 몇 명의 간호 종사자와 함께 둥지 상자로 옮겨집니다. 이 프로토콜은 개미의 카스트 특이적 생리학 및 사회적 행동 분석을 위한 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하지만 더 넓은 범위의 hymenopteran 및 기타 곤충에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
곤충의 진사회성, 즉 Hymenoptera와 Blattodea (이전의 Isoptera)의 진화는 개인과 식민지 수준 모두에서 나타나는 독특하고 종종 정교한 행동 특성을 초래했습니다. 가장 진보 된 사회 곤충 그룹을 특징 짓는 특성 인 생식 분업은 종종 여러 행동 적으로 그리고 종종 형태 학적으로 독특한 그룹으로 구성된 카스트 제도를 포함합니다. 카스트 간의 이러한 행동 및 형태 학적 다양성은 유전 체계뿐만 아니라 종종 환경 1,2,3,4에 의해 통제되어 진생 곤충을 유전 및 후성 유전 학적 연구에 매력적인 주제로 만듭니다.
진사회적 곤충의 유전 시스템을 조작하는 능력은 많은 종들이 실험실 환경에서 짝짓기 및 번식하지 않기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다. 대부분의 eusocial 곤충은 또한 식민지에 생식 개체가 거의 없기 때문에 생산할 수있는 자손의 수를 제한하고 결과적으로 유전자 조작을위한 표본 크기를 제한합니다5. 또한, 많은 진사회적 곤충은 유전 연구에 일반적으로 사용되는 곤충(예: 초파리)에 비해 생성 시간이 길기 때문에유전 계통을 설정하는 데 어려움이 가중됩니다5. 그러나 일부 eusocial 종은 식민지에서 생식 활성 개체의 상당 부분을 생성 할 수 있으며, 이는 문제를 완화하고 돌연변이 또는 형질 전환 계통을 확립 할 수있는 기회를 제공합니다.
포네린 개미 종인 하르페냐토스 살타토르(Harpegnathos saltator)의 경우, 모든 여성 노동자는 여왕의 죽음이나 사회적 고립에 따라 생식 활동을 할 수 있습니다. 이러한 작업자를 “게이머게이트”라고 하며 새로운 식민지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다6. 더욱이, 하나의 군집에 하나 이상의 게이머게이트가 존재할 수 있어서,자손 생산5,7,8을 증가시킨다. 지금까지 돌연변이 및 / 또는 형질 전환 계통은 유럽 꿀벌 인 Apis mellifera와 개미 종, H. saltator, Ooceraea biroi 및 Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15에서 개발되었습니다. . 사회적 꿀벌과 개미의 유전자 분석은 유전자와 유전자가 진사회적 곤충 행동 및 카스트 특정 생리학에 미치는 영향을 연구할 수 있는 다양한 기회를 제공하여 진사회성에 대한 더 나은 이해를 향한 길을 열었습니다.
여기에서는 H. saltator의 CRISPR / Cas9 시스템을 통한 유전자 변형 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 기술은 모든 냄새 수용체 (OR)의 절대 공동 수용체를 암호화하는 유전자 인 orco에서 생식선 돌연변이를 생성하는 데 사용되었습니다.10. OR 유전자는 hymenopteran eusocial 곤충16에서 현저하게 확장되었으며, orco는 곤충 후각에 필수적인 역할을합니다. 부재시 OR은 정상적으로 조립되거나 작동하지 않습니다. 따라서 orco 유전자의 돌연변이는 후각 감각, 신경 발달 및 관련 사회적 행동을 방해합니다 9,10.
이 프로토콜에서는 Cas9 단백질과 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 표적 유전자의 돌연변이 유발을 유도할 목적으로 미세 주입을 사용하여 개미 배아에 도입합니다. 여기에서는 콜로니 및 주입 된 배아의 관리에 관한 지침과 함께 미세 주입 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 방법은 H. saltator 개미의 다양한 유전자에서 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하며 더 넓은 스펙트럼의 hymenopteran 곤충에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
개미, 벌, 말벌, 흰개미를 포함한 곤충들 사이에서 우사회성의 진화는 새로운 행동 및 형태학적 특성의 출현을 가져왔으며, 그 중 많은 부분이 환경 및 유전적 요인의 조합에 의해 영향을 받는 것으로 이해됩니다1,2,3,4. 불행히도, 유전학 분야의 연구 모델로서의 eusocial 곤충의 매력과 유용성은이 그룹?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 뉴욕 대학의 Danny Reinberg와 Claude Desplan의 실험실과 애리조나 주립 대학의 Jürgen Liebig의 실험실에 개미 유전학에 대한 지원에 감사드립니다. Hua Yan은 국립 과학 재단 I/UCRC, 보조금 번호 IIP-1821914에 따른 절지동물 관리 기술 센터 및 업계 파트너의 지원을 인정합니다. Maya Saar는 미국-이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금, Vaadia-BARD 박사후 연구원 번호 FI-595-19의 지원을 받았습니다.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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