Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi
Summary
De nombreuses caractéristiques de l’eusocialité des insectes reposent sur la communication au sein de la colonie et la division du travail. La manipulation génétique des gènes régulateurs clés dans les embryons de fourmis par micro-injection et mutagénèse médiée par CRISPR donne un aperçu de la nature du comportement altruiste chez les insectes eusociaux.
Abstract
Les traits uniques des insectes eusociaux, tels que le comportement social et la division reproductive du travail, sont contrôlés par leur système génétique. Pour comprendre comment les gènes régulent les traits sociaux, nous avons développé des fourmis mutantes via l’administration du complexe CRISPR dans de jeunes embryons au cours de leur phase syncytiale. Ici, nous fournissons un protocole de mutagénèse médiée par CRISPR dans Harpegnathos saltator, une espèce de fourmi ponérine qui présente une plasticité phénotypique frappante. Les fourmis H. saltator sont facilement élevées en laboratoire. Les embryons sont collectés pour la micro-injection avec des protéines Cas9 et des petits ARN guides synthétisés in vitro (ARNsg) à l’aide d’aiguilles de quartz faites maison. Les embryons post-injection sont élevés à l’extérieur de la colonie. Après l’émergence de la première larve, tous les embryons et les larves sont transportés dans un nichoir avec quelques travailleurs infirmiers pour un développement ultérieur. Ce protocole convient pour induire la mutagénèse pour l’analyse de la physiologie spécifique à la caste et du comportement social chez les fourmis, mais peut également être appliqué à un spectre plus large d’hyménoptères et d’autres insectes.
Introduction
L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, à savoir ceux des ordres Hymenoptera et Blattodea (anciennement Isoptera), a abouti à des traits comportementaux uniques et souvent sophistiqués qui se manifestent à la fois au niveau individuel et au niveau de la colonie. La division reproductive du travail, un trait caractérisant les groupes les plus avancés d’insectes sociaux, implique souvent des systèmes de castes composés de plusieurs groupes comportementaux et souvent morphologiquement distincts. Cette diversité comportementale et morphologique entre les castes est contrôlée non seulement par leur système génétique, mais aussi souvent par l’environnement 1,2,3,4, faisant des insectes eusociaux des sujets attrayants pour la recherche génétique et épigénétique.
La capacité de manipuler le système génétique des insectes eusociaux s’est avérée difficile, car de nombreuses espèces ne s’accouplent pas et ne se reproduisent pas en laboratoire. La plupart des insectes eusociaux ont également très peu d’individus reproducteurs dans une colonie, ce qui limite le nombre de descendants pouvant être produits et, par conséquent, limite la taille de l’échantillon pour la manipulation génétique5. De plus, de nombreux insectes eusociaux ont des temps de génération longs par rapport aux insectes couramment utilisés pour les études génétiques (tels que la drosophile), ce qui ajoute à la difficulté d’établir des lignées génétiques5. Certaines espèces eusociales, cependant, peuvent générer une grande proportion d’individus actifs sur le plan de la reproduction dans une colonie, ce qui atténue les défis et offre des possibilités d’établir des lignées mutantes ou transgéniques.
Dans le cas de l’espèce de fourmi ponérine, Harpegnathos saltator, toutes les travailleuses peuvent devenir actives sur le plan reproductif à la mort d’une reine ou à l’isolement social. Ces ouvrières sont appelées « gamégates » et peuvent être utilisées pour générer de nouvelles colonies6. De plus, il peut y avoir plus d’un gamergate présent dans une colonie, augmentant ainsi la production de progéniture 5,7,8. Jusqu’à présent, des lignées mutantes et/ou transgéniques ont été développées chez l’abeille européenne Apis mellifera, et chez les espèces de fourmis, H. saltator, Ooceraea biroi et Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Les analyses génétiques chez les abeilles sociales et les fourmis ont ouvert la voie à une meilleure compréhension de l’eusocialité, offrant un éventail d’opportunités pour étudier les gènes et leurs impacts sur le comportement des insectes eusociaux et la physiologie spécifique à la caste.
Ici, nous fournissons un protocole de modification génétique via le système CRISPR / Cas9 dans H. saltator. Plus précisément, cette technique a été utilisée pour générer une mutation germinale chez l’orco, le gène codant pour le corécepteur obligatoire de tous les récepteurs odorants (OR)10. Les gènes OR ont été remarquablement développés chez les insectes eusociaux hyménoptères16, et l’orco joue un rôle essentiel dans l’olfaction des insectes; en son absence, les RO ne s’assemblent pas et ne fonctionnent pas normalement. Les mutations du gène orco perturbent donc la sensation olfactive, le développement neuronal et les comportements sociaux associés 9,10.
Dans ce protocole, les protéines Cas9 et les petits ARN guides (ARNg) sont introduits dans les embryons de fourmis par micro-injection dans le but d’induire la mutagénèse d’un gène cible. Ici, nous décrirons la procédure de micro-injection en détail ainsi que les instructions concernant les soins des colonies et des embryons injectés. Ces méthodes sont appropriées pour induire la mutagénèse dans une variété de gènes différents chez les fourmis H. saltator et peuvent être appliquées à un spectre plus large d’insectes hyménoptères.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, y compris les fourmis, les abeilles, les guêpes et les termites, a entraîné l’apparition de nouveaux traits comportementaux et morphologiques, dont beaucoup sont influencés par une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques 1,2,3,4. Malheureusement, l’attrait et l’utilité des insectes eusociaux en tant que modèles d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les laboratoires de Danny Reinberg et Claude Desplan à l’Université de New York et le laboratoire de Jürgen Liebig à l’Arizona State University pour leur soutien sur la génétique des fourmis. Hua Yan reconnaît le soutien de la National Science Foundation I / UCRC, du Center for Arthropod Management Technologies sous le numéro de subvention IIP-1821914 et des partenaires de l’industrie. Maya Saar a été soutenue par le Fonds binational de recherche et de développement agricoles États-Unis – Israël, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
Referências
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
