Dette manuskriptet beskriver en metode for målrettet levering til en enkelt nyre via et kateter plassert i den infrarenale abdominal aorta i musen.
Det er behov for rettede injeksjoner for å muliggjøre økt og spesifikk nyreeksponering for effektiv evaluering av narkotikamål på nyreforskningsfeltet. Akkumulering av legemidler i visse organer kan gi opphav til uønskede og uønskede effekter, avhengig av arten av injektat. For å minimere smitte og/eller akkumulering i andre vev, styrer den heri beskrevne metoden formuleringen inn i nyrearteriens blodstrøm ved å sette inn et kateter i infra nyreaorta, like under der den forgrener seg inn i nyrearterien, noe som resulterer i nyrene som først nådde organ og fordeling av formulering gjennom hele nyrene.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av metoden, samt dens utfordringer og vanskeligheter. Den veileder eksperimentet til å bli dyktig med denne typen mikrokirurgi som krever nøyaktighet under sterile forhold. Hastighet er avgjørende for å minimere iskemien og praktisere prosedyren vil øke sjansen for vellykkede injeksjoner uten bivirkninger. Ved å modulere tiden mellom injeksjon og reperfusjon samt det injiserte volumet, reduseres risikoen for smitte til andre organer.
Vær oppmerksom på at denne teknikken er egnet for enkle doseringsstrategier.
På det prekliniske forskningsfeltet innen legemiddelindustrien er modell- og metodeutvikling en del av det daglige arbeidet. Det er en økende interesse for evnen til å lede narkotika til bestemte organer, eller til og med skille rom i et organ, uten større oversvømmelse / entrapment, via blodstrøm, inn i andre vev. Dette for å muliggjøre økt og spesifikk eksponering for effektiv evaluering av legemiddelmål i modeller av ulike sykdomsområder 1,2,3,4.
En vanlig måte å levere stoffer på er ved systemiske ruter (f.eks. via halevenen) siden den er mindre invasiv enn metoden som er beskrevet i dette manuskriptet. Imidlertid øker systemisk administrering risikoen for økt metabolisme eller akkumulering av forbindelsen i andre vev enn det tiltenkte målorganet, når du passerer gjennom filtreringsorganer som lunge, lever og milt 2,3,5. Bortsett fra å ikke nå det bestemte vevet, kan dette potensielt gi opphav til uønskede og / eller uønskede effekter, avhengig av arten av injektat. Bare svært små molekyler passerer kapillærene til filtreringsorganer, og derfor er målrettet levering spesielt viktig hvis du arbeider med større molekyler 6.
For å minimere smitte og/eller akkumulering av injisert formulering, i andre vev, styrer den her beskrevne metoden formuleringen inn i nyrearteriens blodstrøm gjennom et kateter satt inn i buka aorta like under der den forgrener seg inn i nyrearterien, noe som resulterer i nyrene som først nådde organ. En annen fordel med denne veiledede administrasjonen er at en lavere dose/ volum kan brukes for å nå samme eksponeringsnivå som oppnådd via systemisk administrasjon 3.
Andre administrasjonsveier har blitt utforsket, for eksempel injeksjoner via et kateter direkte inn i nyrearterien. I våre hender ble dette funnet å utgjøre en høyere risiko for manglende gjenoppretting av sirkulasjonen til nyrene. Den svært små diameteren på nyrearterien (ca. 0,35-0,55 mm i diameter) gjør snittet relativt stort og utgjør en risiko for obstruksjon og/eller emboli når du lukker inngangshullet. Ifølge vår erfaring oppstod iskemisk-relatert skade på nyrene ofte ved bruk av denne metoden, og vi utviklet derfor denne nye måten å målrette nyrene på ved å injisere stoffer gjennom snitt av større aorta for å målrette nyrene.
Det finnes lignende teknikker som utvikles hos rotter som også manifesterer utfordringene og risikoen for stenose /trombose som arbeider med injeksjoner direkte inn i nyrearterien 5. Dette støtter våre funn siden fartøyene i mus er enda mindre.
Dette manuskriptet og videoen beskriver i detalj hvordan injeksjoner kan rettes inn i nyrearterien hos mus gjennom et kateter satt inn i den infrarenale aorta, samt veiledning i hvordan man kan overvinne vanlige vanskeligheter i prosedyren, å jobbe på den sikreste måten som mulig og dermed øke reproduserbarheten.
Denne metoden har vært vellykket i å levere formuleringer til nyrene uten å forårsake nyreskade. Den kan brukes til levering av alle slags formuleringer (f.eks. små molekyler, stamceller eller stamceller). Metoden kan brukes hos friske dyr eller i nyresykdomsmodeller.
I figur 2 og figur 3presenteres histologien. Figur 2 viser histologi 180 minutter etter perfusjon, mens figur 3 viser historie 7 dager etter infusjon. Årsaken til dette er at forsøkene med nyrearterie bare var 180 minutter lange. For å være sikre på at vi ikke hadde noen kronisk skade med denne nye metoden, ventet vi med vilje 7 dager på å evaluere dem. N-tallet er lite, men dette er bare et eksempel.
Merk at denne nyutviklede metoden for aortaadministrasjon for å målrette nyrene er en invasiv metode med relativt lav gjennomstrømning og er kun egnet for enkelt doseringsstrategier. Gjentatt dosering er ikke mulig med denne metoden.
Med mindre justeringer av ligaturplasseringene kan denne metoden muligens brukes til å tilføre begge nyrene samtidig5,7. Med den økte risikoen for smitte gjennom aorta forgrening bestemte vi oss for å holde okkluderende ligatur så nær nyrene som mulig, noe som førte injeksjonen til venstre nyre bare. Den kan også brukes i tillegg til andre modeller eller teknikker som uninephrectomy eller kanskje til og med samtidig nyre iskemi reperfusjonsskade (IRI). Etter vår mening er det for hardt å gjøre injeksjonen bare 24 timer etter IRI3-operasjonen og vil påvirke dyrets utvinning betydelig.
Når man bruker nye stammer av mus, bør man alltid utføre et piloteksperiment på noen dyr fra den stammen for å sikre at metoden ikke trenger å justeres på en eller annen måte. For eksempel, i noen stammer kan kargreningen fra aorta plasseres litt annerledes. Ligaturenes posisjon kan endres noe for å sikre at formuleringen havner på riktig sted.
Dehydrering
Åpning av bukhulen utgjør en stor risiko for dehydrering. Det er derfor viktig å tilsette væsker (rundt 37 °C) både under og etter operasjonen for å sikre et godt grunnlag for utvinningspost operativt. Vi pleier å gi 1 ml/mus.c. etter operasjonen.
Ischemia
Langvarig operasjonstid eller hvis du ikke når full resirkulering vil resultere i iskemi. Det er viktig å registrere den faktiske iskemitiden og sørge for at sirkulasjonen til nyrene (og bakbenene) gjenopprettes. Konstant trening og forfriskende ferdigheter er, som alltid, viktig. Å utføre prosedyren reduserer raskere tiden nyrene blir utsatt for iskemi. Å holde iskemitiden (ligasjon av aorta) til rundt 5 min (10 min maks) har vist seg å ikke skade nyrene.
Smitteeffekter
Tatt i betraktning risikoen for smitte til andre organer når den injiserte formuleringen kommer inn i sirkulasjonen gjennom nyrevenen, bør det injiserte volumet holdes på et minimum. Vi anbefaler et maksimalt volum på 50 μL. Dosering har også blitt funnet, av andre, å være en kritisk faktor for effektivitet3.
Bivirkninger (trombose og lammelse)
I utgangspunktet når vi satte opp modellen, opplevde vi ikke-konsistente problemer med lammelse i bakbenene. Etter relevant dose antikoagulant (10 IE heparin i hale vene) preoperativt, ble denne bivirkningen betydelig redusert. Etter å ha konsultert eksperter på feltet, begynte vi også å være enda mer forsiktige med å jobbe med atraumatisk kirurgi, noe som betyr ingen klemming i noe vev og berøring av så lite områder som mulig. Disse tiltakene samlet reduserte lammelsesfrekvensen fra rundt 50% til nesten ingen.
I utgangspunktet under metodeutvikling brukte vi antikoagulantvev på nyrearterien for å lukke snitthullet. Dette var ikke mulig når du gjør injeksjoner i aorta siden trykket er så mye høyere i aorta. Antikoagulant øker også risikoen for trombose hvis den kommer inn i fartøyets lumen.
Pass på at du ikke har adventitia eksponert i lumen av aorta når suturering siden adventitia er svært trombogene. Unngå også inverterende sårkanter eller innsnevring av aorta ved å suturere til låret.
Vi har nå en etablert metode for å levere formuleringer direkte til nyrene.
The authors have nothing to disclose.
Takk til René Remie hos RRSSC for å hjelpe meg med å finjustere teknikken og Instech-laboratoriene for samarbeid i å produsere et spesialdesignet kateter. En stor takk også til alle kolleger på AstraZeneca FoU for produktive diskusjoner med tips og triks, samt Xerox for å fullføre videoen med lyd.
Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |