Denne protokol fremkalder ikke-invasivt hyperglykæmi hos zebrafisk i op til 8 uger. Ved hjælp af denne protokol kan der foretages en dybdegående undersøgelse af de negative virkninger af hyperglykæmi.
Zebrafisk (Danio rerio) er en fremragende model til at undersøge virkningerne af kronisk hyperglykæmi, et kendetegn for type II Diabetes Mellitus (T2DM). Denne alternative nedsænkningsprotokol er en ikke-invasiv, trinvis metode til at fremkalde hyperglykæmi i op til otte uger. Voksne zebrafisk udsættes skiftevis for sukker (glukose) og vand i 24 timer hver. Zebrafisken begynder behandling i en 1% glukoseopløsning i 2 uger, derefter en 2% opløsning i 2 uger og endelig en 3% opløsning i de resterende 4 uger. Sammenlignet med vandbehandlede (stress) og mannitolbehandlede (osmotiske) kontroller har glukosebehandlede zebrafisk betydeligt højere blodsukkerniveauer. Den glukosebehandlede zebrafisk viser blodsukkerniveauer på 3 gange så høje som kontroller, hvilket tyder på, at der efter både fire og otte uger kan opnås hyperglykæmi. Vedvarende hyperglykæmi var forbundet med øget Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) og øget nuklear faktor Kappa B (NF-kB) niveauer i nethinden og nedsat fysiologiske reaktioner, samt kognitive underskud tyder på denne protokol kan bruges til at modellere sygdom komplikationer.
Zebrafisk (Danio rerio) er hurtigt ved at blive en udbredt dyremodel til at studere både sygdom og kognition1. Den lette genmanipulation og embryonale gennemsigtighed gennem de tidlige udviklingsstadier gør dem til en oplagt kandidat til at studere menneskelige sygdomme med et kendt genetisk grundlag. For eksempel har zebrafisk været brugt til at studere Holt-Oram syndrom, kardiomyopatier, glomerulocystic nyresygdom, muskeldystrofi, og diabetes mellitus (DM) blandt andre sygdomme1. Derudover er zebrafiskmodellen ideel på grund af artens lille størrelse, let vedligeholdelse og høj fecundity2,3.
Zebrafisk bugspytkirtlen er både anatomisk og funktionelt ligner pattedyr bugspytkirtel4. Således gør de unikke egenskaber ved størrelse, høj fecundity og lignende endokrine strukturer zebrafisk til en egnet kandidat til at studere DM-relaterede komplikationer. I zebrafisk er der to eksperimentelle metoder, der bruges til at fremkalde den langvarige hyperglykæmi, der er karakteristisk for DM: en tilstrømning af glukose (modellering type 2) og ophør af insulinsekretion (modellering type 1)5,6. Eksperimentelt, for at stoppe insulin sekretion, pancreas β-celler kan kemisk ødelægges ved hjælp af enten Streptozotocin (STZ) eller Alloxan injektioner. STZ er blevet brugt med succes i gnavere og zebrafisk, hvilket resulterer i komplikationer forbundet med retinopati7,8,9, kognitive svækkelser10og lemmer regenerering11. Men i zebrafisk regenererer β celler efter behandling, hvilket forårsager ,at “booster injektioner” af STZ er nødvendige for at opretholde diabetiske tilstande12. Alternativt kan bugspytkirtlen af zebrafisk fjernes6. Disse er begge meget invasive procedurer, på grund af de mange injektioner, og omfattende restitutionstid.
Omvendt kan hyperglykæmi induceres noninvasively gennem eksponering for eksogen glukose. I denne protokol nedsænkes fisk i en stærkt koncentreret glukoseopløsning i 24 timer5,13 eller kontinuerligt i 2 uger14,15,16. Eksogen glukose tages op transdermally, ved indtagelse, og / eller på tværs af gællerne resulterer i forhøjet blodsukker. Da denne ikke-invasive teknik ikke direkte manipulerer insulinniveauer, kan den ikke hævde at fremkalde type 2 DM. Det kan dog bruges til at undersøge komplikationer forårsaget af hyperglykæmi, som er et af de vigtigste symptomer på type 2 DM.
For nylig blev zebrafisk mutant pdx1-/- udviklet ved at manipulere bugspytkirtlen og duodenal homeobox 1-genet, et gen knyttet til den genetiske årsag til type 2 DM hos mennesker. Ved hjælp af denne mutant, forskere har været i stand til at kopiere bugspytkirtel udvikling forstyrrelser, højt blodsukker, og undersøgelse hyperglykæmi-induceret diabetisk retinopati17,18.
I dette papir beskriver vi en ikke-invasiv hyperglykæmiinduktionsmetode, der bruger en skiftende nedsænkningsprotokol. Denne protokol opretholder hyperglykæmiske tilstande i op til 8 uger med efterfølgende observerede komplikationer. Kort sagt placeres voksne zebrafisk i en sukkeropløsning i 24 timer og derefter en vandopløsning i 24 timer. I modsætning til kontinuerlig nedsænkning i eksterne glukoseopløsninger efterligner vekslende dage mellem sukker og vand stigningen og faldet af blodsukker i diabetes. En vekslende glukoseprotokol gør det desuden muligt at inducere hyperglykæmi i længere tid, da zebrafisken ikke er så i stand til at kompensere for de høje eksterne glukoseforhold. Som bevis for princippet leverer vi data, der viser, at hyperglykæmi induceret ved hjælp af denne protokol ændrer nethindekemi og fysiologi.
Diabetes er et landsdækkende problem. Undersøgelser viser, at i 2030, en anslået 400 millioner mennesker vil have en form for diabetes. I gnavermodeller undersøges type 2 DM ved hjælp af genmanipulation. Hos rotter giver Zucker diabetiske fede rotter (ZDF) og Otsuka Long-Evans Tokushima fede rotter (OLETF) flere oplysninger om virkningerne af type 2 DM10. Derudover er højt fedtindhold kostvaner blevet brugt i gnaver til at fremkalde hyperglykæmi. Dette afspejler den ikke-invasive procedure,…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende VPC, CJR og MCP for udviklingen af denne protokol. EMM modtog økonomisk støtte fra American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support til at udføre denne forskning. Dette arbejde blev også støttet af en American University Faculty Mellon Award og finansiering gennem American University College of Arts and Sciences (begge til VPC).
Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
Net | petsmart | 5175115 | |
Tanks | Amazon | B0002APZO4 |