3D الخلية المطبوعة سرطان نقص الأكز على رقاقة لتلخيص التقدم المرضي للسرطان الصلب
Summary
نقص الأكسيجة هو السمة المميزة للبيئة الدقيقة الورم ويلعب دورا حاسما في تطور السرطان. تصف هذه المقالة عملية تصنيع سرطان نقص الأكاكس على رقاقة استنادا إلى تقنية طباعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتلخيص أمراض السرطان المرتبطة بنقص الأكسيا.
Abstract
إن البيئة الدقيقة للسرطان لها تأثير كبير على تطور المرض. على وجه الخصوص، نقص الأكxia هو المحرك الرئيسي للبقاء على قيد الحياة السرطان، والغزو، وschemresistance. على الرغم من أنه تم تطوير العديد من النماذج في المختبر لدراسة أمراض السرطان المرتبطة بنقص الأكسيا ، إلا أن التفاعل المعقد للبيئة الدقيقة للسرطان التي لوحظت في الجسم الحي لم يتم استنساخه بعد بسبب عدم وجود رقابة مكانية دقيقة. وبدلا من ذلك، اقترحت نهج تصنيع بيولوجي ثلاثي الأبعاد لإنشاء نظم فيزيائية دقيقة من أجل محاكاة أفضل لإيكولوجيا السرطان وتقييم دقيق لعلاج السرطان المضاد للسرطان. هنا، نقترح نهج الطباعة الخلوية ثلاثية الأبعاد لتصنيع سرطان نقص الأكز على رقاقة. تم تحديد المكونات المحفزة لنقص الأكسيجة في الشريحة على أساس محاكاة حاسوبية لتوزيع الأكسجين. طبعت حلقات متحدة المركز للسرطان ستروما باستخدام البيوينكات التي تحتوي على خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا البطانية لتلخيص نوع من السرطان الصلب. أدركت الشريحة الناتجة نقص الأكسوجة المركزية والخبيثة المشددة في السرطان مع تشكيل علامات الفيزيولوجيا المرضية التمثيلية. وبشكل عام، من المتوقع أن يؤدي النهج المقترح لإنشاء نظام فيزيائي دقيق صلب الميكروبيولوجية المضاد للسرطان إلى سد الفجوة بين النماذج الحية وفي المختبر لأبحاث السرطان.
Introduction
البيئة الدقيقة للسرطان هو عامل حاسم يقود تطور السرطان. تحدد المكونات المتعددة، بما في ذلك الإشارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والخلوية، السمات المرضية للسرطان. من بين هذه, نقص الأكسيا يرتبط ارتباطا قويا مع البقاء على قيد الحياة السرطان, انتشار, والغزو1. بسبب النمو غير المحدود وتقسيم الخلايا السرطانية ، يتم استنفاد المواد الغذائية والأوكسجين باستمرار ، ويتم توليد تدرج نقص الأوكسي. في ظل ظروف منخفضة الأكسجين، تقوم الخلايا بتنشيط عامل النسخ غير القابل للاختزال (HIF) المرتبط بالسلسلة الجزيئية. هذه العملية تحفز نواة نخرية ، وتتسبب في تغييرات التمثيل الغذائي ، وتبدأ تضخم الأوعية الدموية والانبثاث2،3. في وقت لاحق، نقص الأكسيا في الخلايا السرطانية يسبب تدمير الأنسجة الطبيعية المجاورة. وعلاوة على ذلك، يرتبط نقص الأكxia بقوة مع المقاومة العلاجية للأورام الصلبة في آداب متعددة العوامل. نقص الأكسيا قد يعوق بشدة العلاج الإشعاعي، كما الحساسية الإشعاعية محدودة بسبب أنواع الأكسجينالتفاعلية 1،4. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من مستويات الحموضة في البيئات الدقيقة للسرطان ، مما يقلل من تراكم الأدوية1. لذلك ، فإن إعادة إنتاج الميزات المرضية المتعلقة بنقص الأكxia في المختبر هي استراتيجية واعدة للنتائج العلمية وما قبل السريرية.
يعد وضع نماذج لبيئة دقيقة محددة للسرطان أمرا ضروريا لفهم تطور السرطان واستكشاف العلاجات المناسبة. على الرغم من أن النماذج الحيوانية قد استخدمت على نطاق واسع بسبب أهميتها الفسيولوجية القوية ، إلا أن القضايا المتعلقة باختلافات الأنواع والمشاكل الأخلاقية موجودة5. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن النماذج التقليدية 2D و 3D تسمح للتلاعب والتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا السرطانية لتحليل متعمق، لا يمكن إعادة رسملة تعقيدها المعماري والخلوي بالكامل. على سبيل المثال، تم استخدام نماذج كروية السرطان على نطاق واسع، حيث يمكن أن يولد تجميع الخلايا السرطانية في كروية نقص الأكباس بشكل طبيعي في القلب. وعلاوة على ذلك، تم إنتاج أعداد كبيرة من كرويدات الخلوية من حجم موحد باستخدام البلاستيك أو السيليكون القائم على أنظمة متعددةالآبار 6،7. ومع ذلك ، فإن انخفاض المرونة فيما يتعلق بالتقاط الهيكل الدقيق غير المتجانس للأنسجة السرطانية مع المنصات التقليدية يتطلب إنشاء تقنية تصنيع بيولوجي متقدمة لبناء منصة محاكاة حيوية عالية لتحسين أبحاث السرطان8.
أنظمة الفيزيولوجيا الدقيقة ثلاثية الأبعاد (MPSs) هي أدوات مفيدة لتلخيص الهندسة المعقدة والتقدم المرضي للخلايا السرطانية9. كما الخلايا السرطانية الشعور التدرج الكيميائي الحيوي لعوامل النمو وchemkines والتجانس الميكانيكية المستنسخة على النظام، يمكن التحقيق في السمات الهامة لتطوير السرطان في المختبر. على سبيل المثال، تمت دراسة قابلية البقاء للسرطان، الخبيث النقيلي، ومقاومة الأدوية اعتمادا على تركيزات الأكسجين متفاوتة باستخدام MPSs10،11. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن توليد ظروف نقص الأكسيد في النماذج المختبرية يعتمد على إجراءات التصنيع المعقدة ، بما في ذلك الاتصال بمضخات الغاز المادية. لذلك، هناك حاجة إلى طرق بسيطة ومرنة لبناء بيئة دقيقة خاصة بالسرطان.
اكتسبت تكنولوجيا الطباعة الخلوية ثلاثية الأبعاد اهتماما كبيرا بسبب سيطرتها الدقيقة على الترتيب المكاني للمواد الحيوية لتلخيص العمارات البيولوجية الأصلية12. وعلى وجه الخصوص، تتغلب هذه التكنولوجيا على القيود القائمة لنماذج نقص الأكxia ثلاثية الأبعاد بسبب قدرتها العالية على التحكم وجدوى بناء السمات المكانية للبيئة الدقيقة للسرطان. كما تسهل الطباعة ثلاثية الأبعاد التصنيع بمساعدة الكمبيوتر من خلال عملية طبقة تلو الأخرى، وبالتالي توفير بناء سريع ودقيق وقابل للاستنساخ للهندسة المعقدة لمحاكاة معماريات الأنسجة الفعلية. بالإضافة إلى مزايا استراتيجيات التصنيع القائمة ل MPSs ثلاثية الأبعاد ، يمكن إعادة إنتاج السمات المرضية الفسيولوجية لتطور السرطان عن طريق نقش المكونات الكيميائية الحيوية والخلوية والفيزيائية الحيوية13،14.
هنا، نقدم استراتيجية طباعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لسرطان نقص الأكز على رقاقة لتلخيص عدم التجانس لسرطان صلب (الشكل 1)15. تم تحديد معلمات التصنيع من خلال محاكاة حسابية لتشكيل نقص الأكxia المركزي في النظام. تمت طباعة حلقات متحدة المركز للسرطان ستروما باستخدام نباتات الكولاجين التي تحتوي على خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا البطانية لمحاكاة الفيزيولوجيا المرضية للورم الأرومي الدبقي، وهو نوع من السرطان الصلب. تشكيل تدرج الأكسجين الشعاعي تفاقم خبيثة السرطان، مما يدل على العدوانية المعززة. وعلاوة على ذلك، فإننا تشير إلى وجهات النظر المستقبلية لتطبيقات رقاقة لنماذج ما قبل السريرية المريض محددة. ومن المتوقع أن يؤدي النهج المقترح لإنشاء نظام فيزيائي دقيق صلب الميكروبيولوجية السرطانية إلى سد الفجوة بين نماذج السرطان الحية والمضموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن نصف عملية تصنيع سرطان نقص الأكز على رقاقة على أساس تكنولوجيا الطباعة الخلوية 3D. تم التنبؤ بتكوين التدرج نقص الأكز في الشريحة المصممة من خلال المحاكاة الحاسوبية. واستنسخت البيئة التي يمكن أن تحفز تدرجا غير متجانس لنقص الأوكسي عن طريق استراتيجية بسيطة تجمع بين الحاجز ن?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (رقم 2020R1A6A1A03047902 و NRF-2018H1A2A1062091) والحكومة الكورية (رقم. NRF-2019R1C1C1009606 و NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
Referências
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengenharia. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
