3D-celgeprinte hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van pathologische progressie van solide kanker
Summary
Hypoxie is een kenmerk van tumormicromilieu en speelt een cruciale rol bij de progressie van kanker. Dit artikel beschrijft het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie om een hypoxiegerelateerde pathologie van kanker samen te vatten.
Abstract
Micromilieu van kanker heeft een aanzienlijke invloed op de progressie van de ziekte. In het bijzonder is hypoxie de belangrijkste oorzaak van overleving, invasie en chemoresistentie van kanker. Hoewel verschillende in vitro modellen zijn ontwikkeld om hypoxiegerelateerde kankerpathologie te bestuderen, is het complexe samenspel van de in vivo waargenomen micromilieu voor kanker nog niet gereproduceerd vanwege het gebrek aan nauwkeurige ruimtelijke controle. In plaats daarvan zijn 3D-biofabrication-benaderingen voorgesteld om microfysiologische systemen te creëren voor een betere emulatie van kankerecologie en nauwkeurige evaluatie van de behandeling van kanker. Hierin stellen we een 3D-celprintbenadering voor om een hypoxische kanker-op-een-chip te fabriceren. De hypoxie-inducerende componenten in de chip werden bepaald op basis van een computersimulatie van de zuurstofverdeling. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van bioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om een type solide kanker samen te vatten. De resulterende chip realiseerde centrale hypoxie en verergerde maligniteit bij kanker met de vorming van representatieve pathofysiologische markers. Over het geheel genomen zal de voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide kanker-mimetisch microfysiologisch systeem naar verwachting de kloof overbruggen tussen in vivo en in vitro modellen voor kankeronderzoek.
Introduction
De micromilieu van kanker is een kritische factor die de progressie van kanker aansturen. Meerdere componenten, waaronder biochemische, biofysische en cellulaire signalen, bepalen de pathologische kenmerken van kanker. Onder deze, hypoxie is sterk geassocieerd met kanker overleving, proliferatie, en invasie1. Door de onbeperkte groei en deling van kankercellen raken voedingsstoffen en zuurstof continu uitgeput en ontstaat er een hypoxische gradiënt. Onder zuurstofarme omstandigheden activeren cellen hypoxie-induceerbare transcriptiefactor (HIF)-geassocieerde moleculaire cascade. Dit proces induceert een necrotische kern, activeert metabolische veranderingen en initieert hyperplasie en metastase van bloedvaten2,3. Vervolgens veroorzaakt hypoxie in kankercellen de vernietiging van naburige normale weefsels. Bovendien wordt hypoxie sterk geassocieerd met de therapeutische weerstand van solide tumoren op multifactoriële manieren. Hypoxie kan radiotherapie ernstig belemmeren, aangezien de radiogevoeligheid beperkt is als gevolg van reactieve zuurstofsoorten1,4. Bovendien verlaagt het de pH-niveaus van micromilieus voor kanker, wat de accumulatie van geneesmiddelen vermindert1. Daarom is het reproduceren van pathologische kenmerken met betrekking tot hypoxie in vitro een veelbelovende strategie voor wetenschappelijke en preklinische bevindingen.
Het modelleren van een specifiek micromilieu van kanker is essentieel voor het begrijpen van de ontwikkeling van kanker en het verkennen van geschikte behandelingen. Hoewel diermodellen veel zijn gebruikt vanwege hun sterke fysiologische relevantie, bestaan er problemen met betrekking tot soortenverschillen en ethische problemen5. Hoewel conventionele 2D- en 3D-modellen de manipulatie en real-time beeldvorming van kankercellen mogelijk maken voor een diepgaande analyse, kan hun architecturale en cellulaire complexiteit niet volledig worden samengevat. Kankersferoïdemodellen zijn bijvoorbeeld veel gebruikt, omdat kankercelaggregatie in een sferoïde van nature hypoxie in de kern kan genereren. Bovendien zijn grote aantallen cellulaire sferoïden van uniforme grootte geproduceerd met behulp van op plastic of siliconen gebaseerde multiputsystemen6,7. De lagere flexibiliteit met betrekking tot het vastleggen van de exacte heterogene structuur van kankerweefsels met conventionele platforms heeft echter de oprichting van een geavanceerde biofabrication-technologie vereist om een zeer biomimetisch platform te bouwen om kankeronderzoek te verbeteren8.
3D-microfysiologische systemen (MPS’s) zijn nuttige hulpmiddelen om de complexe geometrie en pathologische progressie van kankercellen samen tevatten 9. Aangezien kankercellen de biochemische gradiënt van groeifactoren en chemokinen en de mechanische heterogeniteit die op het systeem wordt gereproduceerd, voelen, kunnen belangrijke kenmerken van kankerontwikkeling in vitro worden onderzocht. Bijvoorbeeld, kanker levensvatbaarheid, gemetastaseerde maligniteit, en resistentie tegen geneesmiddelen afhankelijk van de variërende zuurstofconcentraties is bestudeerd met behulp van MPSs10,11. Ondanks recente vooruitgang is het genereren van hypoxische omstandigheden van in vitro modellen afhankelijk van complexe fabricageprocedures, waaronder aansluiting op fysieke gaspompen. Daarom zijn eenvoudige en flexibele methoden nodig om kankerspecifieke micromilieus op te bouwen.
3D-celdruktechnologie heeft veel aandacht gekregen vanwege de nauwkeurige controle van de ruimtelijke ordening van biomaterialen om inheemse biologische architecturen samen tevatten 12. Deze technologie overwint met name de bestaande beperkingen van 3D-hypoxiemodellen vanwege de hoge beheersbaarheid en haalbaarheid voor het bouwen van de ruimtelijke kenmerken van het kankermicromilieu. 3D-printen vergemakkelijkt ook computerondersteunde productie door middel van een laag-voor-laag proces, waardoor een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare constructie van complexe geometrieën wordt geboden om echte weefselarchitecturen na te bootsen. Naast de voordelen van bestaande productiestrategieën voor 3D-MPS ‘s, kunnen de pathofysiologische kenmerken van kankerprogressie worden gereproduceerd door de biochemische, cellulaire en biofysische componenten13,14te patroonen .
Hierin presenteren we een 3D-celprintstrategie voor een hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van de heterogeniteit van een solide kanker (Figuur 1)15. De fabricageparameters werden bepaald via een computationele simulatie van centrale hypoxievorming in het systeem. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van collageenbioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om de pathofysiologie van glioblastoom, een type vaste kanker, na te bootsen. De vorming van een radiale zuurstofgradiënt verergerde de maligniteit van kanker, wat wijst op versterkte agressiviteit. Verder geven we toekomstperspectieven aan voor de toepassingen van de chip op patiëntspecifieke preklinische modellen. De voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide-kanker-mimetisch microfysiologisch systeem zal naar verwachting de kloof tussen in vivo en in vitro modellen van kanker overbruggen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie. De vorming van de hypoxische gradiënt in de ontworpen chip werd voorspeld door middel van computersimulaties. De omgeving die een heterogene hypoxische gradiënt kan veroorzaken, werd gereproduceerd via een eenvoudige strategie die de 3D-geprinte gasdoorlatende barrière en de glazen afdekking combineert. De hypoxie-gerelateerde pathologische kenmerken van glioblastoom, waaronder pseudopalisade en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs (nr. 2020R1A6A1A03047902 en NRF-2018H1A2A1062091) en de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. NRF-2019R1C1C1009606 en NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
Referências
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengenharia. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
