Cancro ipossia stampato in cellule 3D su chip per ricapitolare la progressione patologica del cancro solido
Summary
L’ipossia è un segno distintivo del microambiente tumorale e svolge un ruolo cruciale nella progressione del cancro. Questo articolo descrive il processo di fabbricazione di un cancro ipossico su chip basato sulla tecnologia di stampa cellulare 3D per ricapitolare una patologia del cancro correlata all’ipossia.
Abstract
Il microambiente tumorale ha un impatto significativo sulla progressione della malattia. In particolare, l’ipossia è il principale motore della sopravvivenza, dell’invasione e della chemoresistance del cancro. Sebbene siano stati sviluppati diversi modelli in vitro per studiare la patologia del cancro legata all’ipossia, la complessa interazione del microambiente tumorale osservato in vivo non è stata ancora riprodotta a causa della mancanza di un preciso controllo spaziale. Invece, sono stati proposti approcci di biofabbricazione 3D per creare sistemi microfisiologici per una migliore emulazione dell’ecologia del cancro e un’accurata valutazione del trattamento antitumorali. Qui, proponiamo un approccio di stampa cellulare 3D per fabbricare un cancro ipossico su un chip. I componenti ipossia-inducenti nel chip sono stati determinati sulla base di una simulazione al computer della distribuzione dell’ossigeno. Gli anelli concentrici dello stroma tumorale sono stati stampati utilizzando bioinchiostri contenenti cellule di glioblastoma e cellule endoteliali per ricapitolare un tipo di cancro solido. Il chip risultante ha realizzato ipossia centrale e malignità aggravata nel cancro con la formazione di marcatori fisiopatologici rappresentativi. Nel complesso, l’approccio proposto per la creazione di un sistema microfisiologico solido-cancero-mimetico dovrebbe colmare il divario tra modelli in vivo e in vitro per la ricerca sul cancro.
Introduction
Il microambiente oncologico è un fattore critico che guida la progressione del cancro. Più componenti, inclusi segnali biochimici, biofisici e cellulari, determinano le caratteristiche patologiche del cancro. Tra questi, l’ipossia è fortemente associata alla sopravvivenza, alla proliferazione e all’invasionedel cancro 1. A causa della crescita e della divisione illimitate di cellule tumorali, i nutrienti e l’ossigeno sono continuamente esauriti e viene generato un gradiente ipossia. In condizioni di basso ossigeno, le cellule attivano la cascata molecolare associata al fattore di trascrizione ipossia-inducibile (HIF). Questo processo induce un nucleo necrotico, innesca cambiamenti metabolici e avvia l’iperplasia e la metastasi dei vasisanguigni 2,3. Successivamente, l’ipossia nelle cellule tumorali causa la distruzione dei tessuti normali vicini. Inoltre, l’ipossia è fortemente associata alla resistenza terapeutica dei tumori solidi in modi multifattoriali. L’ipossia può ostacolare gravemente la radioterapia, in quanto la radiosensibilità è limitata a causa della speciereattiva dell’ossigeno 1,4. Inoltre, diminuisce i livelli di pH dei microambientati tumorali, il che diminuisce l’accumulo difarmaci 1. Pertanto, la riproduzione di caratteristiche patologiche legate all’ipossia in vitro è una strategia promettente per i risultati scientifici e precli clinici.
La modellazione di un microambiente specifico del cancro è essenziale per comprendere lo sviluppo del cancro ed esplorare trattamenti appropriati. Sebbene i modelli animali siano stati ampiamente utilizzati a causa della loro forte rilevanza fisiologica, esistono problemi relativi alle differenze di specie e ai problemietici 5. Inoltre, sebbene i modelli 2D e 3D convenzionali consentano la manipolazione e l’imaging in tempo reale delle cellule tumorali per un’analisi approfondita, la loro complessità architettonica e cellulare non può essere completamente riepilogata. Ad esempio, i modelli di sferoidi tumorali sono stati ampiamente utilizzati, poiché l’aggregazione delle cellule tumorali in uno sferoide può generare naturalmente ipossia nel nucleo. Inoltre, un gran numero di sferoidi cellulari di dimensioni uniformi sono stati prodotti utilizzando sistemi multi-pozzo a base di plastica o silicone6,7. Tuttavia, la minore flessibilità per quanto riguarda la cattura dell’esatta struttura eterogenea dei tessuti cancerosi con piattaforme convenzionali ha richiesto la creazione di una tecnologia avanzata di biofabbricazione per costruire una piattaforma altamente biomimetica per migliorare la ricerca sulcancro 8.
I sistemi microfisiologici 3D (MPS) sono strumenti utili per ricapitolare la complessa geometria e progressione patologica delle cellule tumorali9. Poiché le cellule tumorali percepisce il gradiente biochimico dei fattori di crescita e delle chemiochine e l’eterogeneità meccanica riprodotta sul sistema, importanti caratteristiche dello sviluppo del cancro possono essere studiate in vitro. Ad esempio, la vitalità del cancro, la malignità metastatica e la resistenza ai farmaci a seconda delle diverse concentrazioni di ossigeno sono state studiate utilizzando MPS10,11. Nonostante i recenti progressi, la generazione di condizioni ipossiche di modelli in vitro si basa su complesse procedure di fabbricazione, incluso il collegamento con pompe di gas fisiche. Pertanto, sono necessari metodi semplici e flessibili per costruire microambientati specifici per il cancro.
La tecnologia di stampa cellulare 3D ha attirato notevole attenzione grazie al suo preciso controllo della disposizione spaziale dei biomateriali per ricapitolare architetture biologiche native12. In particolare, questa tecnologia supera i limiti esistenti dei modelli di ipossia 3D grazie alla sua elevata controllabilità e fattibilità per costruire le caratteristiche spaziali del microambiente tumorali. La stampa 3D facilita anche la produzione computer-aided attraverso un processo strato per strato, fornendo così una costruzione rapida, accurata e riproducibile di geometrie complesse per imitare le architetture tissutali reali. Oltre ai vantaggi delle strategie di produzione esistenti per gli MPS 3D, le caratteristiche fisiopatiche della progressione del cancro possono essere riprodotte modellando i componenti biochimici, cellulari e biofisici13,14.
Nel presente documento, presentiamo una strategia di stampa cellulare 3D per un cancro ipossico su chip per ricapitolare l’eterogeneità di un cancro solido (Figura 1)15. I parametri di fabbricazione sono stati determinati attraverso una simulazione computazionale della formazione centrale di ipossia nel sistema. Gli anelli concentrici dello stroma tumorale sono stati stampati utilizzando bioinchiostri di collagene contenenti cellule di glioblastoma e cellule endoteliali per emulare la fisiopatologia del glioblastoma, un tipo di cancro solido. La formazione di un gradiente radiale di ossigeno aggravava la malignità del cancro, indicando una maggiore aggressività. Inoltre, indichiamo prospettive future per le applicazioni del chip a modelli preclinici specifici del paziente. L’approccio proposto per la creazione di un sistema microfisiologico solido-cancero-mimetico dovrebbe colmare il divario tra modelli di cancro in vivo e in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, descriviamo il processo di fabbricazione di un cancro ipossico su chip basato sulla tecnologia di stampa cellulare 3D. La formazione del gradiente ipossia nel chip progettato è stata prevista attraverso simulazioni al computer. L’ambiente in grado di indurre un gradiente ipossia eterogeneo è stato riprodotto attraverso una semplice strategia che combina la barriera permeabile al gas stampata in 3D e la copertura in vetro. Le caratteristiche patologiche correlate all’ipossia del glioblastoma, tra cui l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero dell’Istruzione (n. 2020R1A6A1A03047902 e NRF-2018H1A2A1062091) e dal governo coreano (MSIT) (n. NRF-2019R1C1C1009606 e NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
Referências
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