コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

Summary

本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex vivoインキュベーションによって損傷組織に向かって移動する細胞を観察するリアルタイムイメージング法を提示する。

Abstract

間葉系幹細胞(MCs)が細胞再生および治療に及ぼす影響を調べ、人工内皮との共培養後のMSC移行および形態学的変化を追跡する。コルティの器官は、解剖中に発生したライスナーの膜の一部を押すことによってプラスチックカバースリップに固定化された。ガラスシリンダーで閉じ込められたMSCは、シリンダーが取り外されたときに人工内皮上皮に移行した。彼らの主な局在は、コルチの器官の透析で観察され、神経線維と同様の方向に整列した。しかし、いくつかのMSCは、手足の領域に局在し、水平に細長い形状を示した。また、毛細胞領域への移動が増加し、カナマイシン処理後にMSCの形態が様々な形態に変化した。結論として、この研究の結果は、人工内皮とのMSCの共培養が細胞移植による治療薬の開発および様々な条件および要因を調べることができる細胞再生の研究に有用であることを示している。

Introduction

難聴は先天的に起こり得るか、加齢、薬物、騒音を含むいくつかの要因によって徐々に引き起こされる可能性がある。難聴は、聴力を担う毛細胞が損傷した後に機能障害を回復することは非常に困難であるため、しばしば治療が困難^である。世界保健機関(WHO)によると、世界の4億6,100万人が難聴と推定されており、これは世界人口の6.1%を占めています。難聴者のうち93%が成人で、7%が子供です。

多くのアプローチは、難聴を治療するために試みられてきた;特に、MSCを用いた再生アプローチが有望な治療法として登場している。組織が損傷すると、MSCは循環系に自然に放出され、損傷部位に移動し、そこで様々な分子を分泌して再生を促進する微小環境を形成する^2。したがって、外部移植されたMSCを標的とする臓器への移行と、強力な免疫調節、血管新生、および抗アポトーシスを引き起こす分子のその後の分泌を通じて損傷した組織を治療する方法を開発することが重要であり、損傷した^{細胞機能3、4、5}の回復を強化する。

MSCが損傷した組織に移行するホーミングプロセスは、克服すべき最も重要な障害である可能性があります。MSCには、テザリング/ローリング、活性化、逮捕、トランスマイグレーション/ダイアペデス、および移行^6、7、8の順次ステップを備えた全身ホーミングメカニズムがあります。現在、これらのステップを改善する方法を特定するための取り組みが進行中です。遺伝子組み換え、細胞表面工学、インビトロプライミング、磁気誘導など、さまざまな戦略が^6,7で試験されています。さらに、損傷した人工内毛部位にMSCをホーミングすることにより、聴覚毛細胞の保護と再生を促進するためにいくつかの試みがなされている。しかし、インビボでのMSCの追跡は時間と労力を要し、高度に専門的なスキルを必要と^{します 9}.

この問題を解決するために、数時間にわたって細胞の移動を撮影するタイムラプス共焦点顕微鏡を介して、内腔内のMSCのホーミングを観察する方法が開発された(図1)。それは20^世紀 初めに開発され、最近特定の細胞の移動を研究するための強力なツールとなっています。

図1:図1:(A)コルティの解剖された器官が鉗子を用いてプラスチックカバースリップに付着した後、カバースリップは35mmガラス底の共焦点顕微鏡皿に置かれ、(B)ガラスシリンダーが配置される。(C)ガラスシリンダーの内部を媒体で充填した後、(D)GFPラベル付きMSCを媒体で慎重にシリンダーの外に追加する。(E)一晩のインキュベーション後、ガラスシリンダーを取り外し、画像を共焦点顕微鏡で撮影する。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC = 間葉系幹細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

ICRマウスを含むすべての研究プロトコルは、元州医科大学延世大学の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験は世界医師会倫理規定に従って行われた。このプロトコルでは、妊娠中のICRマウスを12/12時間の明暗サイクルに保ち、食物および水に自由にアクセスした。 1. コクリー解剖 紫外線を30分間オンにして層流組織培養フードを殺菌し、?…

Representative Results

3次元モードにおけるMSCのインビトロ移行は、トランスウェルシステムまたは従来の創傷治癒法によって評価され、2次元(2D)モード11での移動を観察する。コルティの器官は、ボエッチャー細胞、クラウディウス細胞、Deiters細胞、ピラー細胞、ヘンセン細胞、外毛細胞、内毛細胞、神経線維、バジル膜、および網状層層などの様々な細胞から構成され?…

Discussion

損傷した細胞の再生を促進するために、損傷部位へのMSCの移植が広範囲に研究されており、治療効果が明らかである。移植とその後のMCの分化は、3-ニトロプロピオン酸¹³によって誘発される難聴を有するラットの聴力を回復させることが報告されている。Leeらはヒトに対してMSCをトランスベンで適用したが、彼らは聴覚¹⁴において有意な改善を達成しなか?…

Materials

10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787