In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging for å utforske cellemigrasjon mot Corti-organet

Summary

I denne studien presenterer vi en sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av konfokal mikroskopi for å observere celler som beveger seg mot skadet vev ved eksvivosinkubasjon med cochlea-epitelet som inneholder Cortis organ.

Abstract

For å studere effekten av mesenchymale stamceller (MSC) på celleregenerering og behandling, sporer denne metoden MSC-migrasjon og morfologiske endringer etter samkultur med cochlea epitel. Cortis organ ble immobilisert på en plastdekslerlip ved å trykke på en del av Reissners membran generert under disseksjonen. MSCer begrenset av en glasssylinder migrerte mot cochlea epitel da sylinderen ble fjernet. Deres dominerende lokalisering ble observert i modiolus av Corti-organet, justert i en retning som ligner på nervefibrene. Noen MSCer ble imidlertid lokalisert i limbussområdet og viste en horisontalt langstrakt form. I tillegg ble migrasjon til hårcelleområdet økt, og morfologien til MSCene endret seg til ulike former etter kanamycinbehandling. Til slutt indikerer resultatene av denne studien at kokulturen av MSC med cochlea epitel vil være nyttig for utvikling av terapeutiske behandlinger via celletransplantasjon og for studier av celleregenerering som kan undersøke ulike forhold og faktorer.

Introduction

Hørselstap kan forekomme medfødt eller kan forårsakes gradvis av flere faktorer, inkludert aldring, narkotika og støy. Hørselstap er ofte vanskelig å behandle fordi det er svært utfordrende å gjenopprette nedsatt funksjon når hårcellene som er ansvarlige for hørselen er skadet¹. Ifølge Verdens helseorganisasjon anslås 461 millioner mennesker over hele verden å ha hørselstap, noe som utgjør 6,1% av verdens befolkning. Av dem med hørselstap er 93 % voksne, og 7 % er barn.

En rekke tilnærminger har blitt forsøkt behandlet med hørselstap; spesielt har en regenereringstilnærming ved hjelp av MSC dukket opp som en lovende behandling. Når vev er skadet, slippes MSC naturlig ut i sirkulasjonssystemet og migrerer til skadestedet der de skiller ut ulike molekyler for å danne et mikromiljø som fremmer regenerering². Derfor er det viktig å utvikle en metode for å behandle skadede vev gjennom migrering av eksternt implanterte MSCer for å målrette organer og deres etterfølgende sekresjon av molekyler som forårsaker potent immunregulering, angiogenese og anti-apoptose for å forbedre restaureringen av skadet cellefunksjon^3,4,5.

Homing prosessen der MSCs migrerer til skadet vev kan være det viktigste hinderet å overvinne. MSCer har en systemisk homing-mekanisme med sekvensielle trinn for tethering/valsing, aktivering, arrestasjon, transmigrasjon/diapedese og migrering^6,7,8. For tiden arbeides det med å identifisere måter å forbedre disse trinnene på. Ulike strategier, inkludert genetisk modifikasjon, celleoverflateteknikk, in vitro-grunning og magnetisk veiledning, er testet^6,7. I tillegg er det gjort flere forsøk på å fremme beskyttelse og regenerering av auditive hårceller ved å homing MSCs til stedet for skadet cochlea. Sporing av MSCer in vivo er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende og krever svært spesialiserte ferdigheter⁹.

For å løse dette problemet ble det utviklet en metode for å observere homing av MSCer i cochlea gjennom tidsforløp konfokal mikroskopi som fotograferer migrering av celler over flere timer (Figur 1). Den ble utviklet tidlig på 1900-tallet og har nylig blitt et kraftig verktøy for å studere migrasjon av spesifikke celler.

Figur 1: Grafisk abstrakt. (A) Etter at det dissekerte organet til Corti er festet på en plastdekslelip ved hjelp av tang, plasseres dekslene på en 35 mm glassbunnet konfokal mikroskopisk tallerken, og (B) glasssylinderen er plassert. (C) Etter at du har fylt innsiden av glasssylinderen med middels, legges GFP-merkede MSCer med medium forsiktig utenfor sylinderen (D) GFP-merkede MSCer med medium. (E) Etter inkubasjon over natten, (F) fjernes glasssylinderen, og bilder tas med et konfokalt mikroskop. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSC = mesenchymale stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle forskningsprotokoller som involverer ICR-mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Yonsei University ved Wonju College of Medicine. Eksperimenter ble utført i henhold til Verdens medisinske forenings etiske retningslinjer. I denne protokollen ble gravide ICR-mus holdt i en 12/12 t lys / mørk syklus med fri tilgang til mat og vann. 1. Cochlea disseksjon Steriliser laminærstrømningsvevskulturhetten ved å slå på ultrafiolett lys i ~ 30 min, …

Representative Results

In vitro-migrering av MSCer i tredimensjonal modus er vurdert av et Transwell-system eller ved den tradisjonelle sårhelingsmetoden for å observere migrasjon i todimensjonal modus (2D)11. Organet i Corti er en kompleks struktur som består av ulike celler som Boettcher-celler, Claudius-celler, Deiters-celler, søyleceller, Hensens celler, ytre hårceller, indre hårceller, nervefibre, basilarmembran og retikululær lamina12. Når MSC-er tra…

Discussion

Transplantasjon av MSC til skadede steder for å fremme regenerering av skadede celler har blitt grundig studert, og den terapeutiske effekten er tydelig. Transplantasjonen og påfølgende differensiering av MSC er rapportert å gjenopprette hørsel hos rotter med hørselstap indusert av 3-nitropropioninsyre¹³. Selv om Lee et al. anvendte MSCer på mennesker trans-venøst, oppnådde de ingen signifikant forbedring i^{hørselen 14}. Inntil nylig ble nesten 12 eksperimenter utf?…

Materials

10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787