Imagerie in vitro de cellules vivantes en accéléré pour explorer la migration cellulaire vers l’organe de Corti
Summary
Dans cette étude, nous présentons une méthode d’imagerie en temps réel utilisant la microscopie confocale pour observer les cellules se déplaçant vers le tissu endommagé par incubation ex vivo avec l’épithélium cochléaire contenant l’organe de Corti.
Abstract
Pour étudier les effets des cellules souches mésenchymateuses (CSM) sur la régénération et le traitement cellulaires, cette méthode suit la migration msc et les changements morphologiques après co-culture avec l’épithélium cochléaire. L’organe de Corti a été immobilisé sur une lame de couverture en plastique en appuyant sur une partie du Reissner’ membrane de s générée pendant la dissection. Les CSM confinés par un cylindre de verre ont migré vers l’épithélium cochléaire lorsque le cylindre a été retiré. Leur localisation prédominante a été observée dans le modiolus de l’organe de Corti, aligné dans une direction similaire à celle des fibres nerveuses. Cependant, quelques CSM ont été localisés dans le secteur de limbus et ont montré une forme horizontalement allongée. En outre, la migration dans le secteur de cellules ciliées a été augmentée, et la morphologie des CSM a changé à de diverses formes après traitement de kanamycin. En conclusion, les résultats de cette étude indiquent que la coculture des CSM avec l’épithélium cochléaire sera utile pour le développement de la thérapeutique par l’intermédiaire de la transplantation cellulaire et pour des études de régénération cellulaire qui peuvent examiner diverses conditions et facteurs.
Introduction
La perte auditive peut survenir congénitalement ou peut être causée progressivement par plusieurs facteurs, y compris le vieillissement, les médicaments et le bruit. La perte auditive est souvent difficile à traiter car il est très difficile de restaurer une fonction altérée une fois que les cellules ciliées responsables de l’audition sont endommagées1. Selon l’Organisation mondiale de la santé, on estime que 461 millions de personnes dans le monde souffrent de perte auditive, ce qui représente 6,1 % de la population mondiale. Parmi les personnes ayant une perte auditive, 93 % sont des adultes et 7 % sont des enfants.
Un certain nombre d’approches ont été tentées pour traiter la perte auditive; notamment, une approche de régénération utilisant des CSM est apparue comme un traitement prometteur. Lorsque les tissus sont endommagés, les CSM sont naturellement libérés dans le système circulatoire et migrent vers le site de la blessure où ils sécrètent diverses molécules pour former un microenvironnement qui favorise la régénération2. Par conséquent, il est important de développer une méthode pour traiter les tissus endommagés par la migration des CSM implantés de l’extérieur vers les organes cibles et leur sécrétion ultérieure de molécules qui provoquent une régulation immunitaire puissante, l’angiogenèse et l’anti-apoptose pour améliorer la restauration de la fonction cellulaire endommagée3,4,5.
Le processus de homing dans lequel les CSM migrent vers les tissus endommagés peut être l’obstacle le plus important à surmonter. Les CSM ont un mécanisme de homing systémique avec des étapes séquentielles d’attache/roulement, d’activation, d’arrêt, de transmigration/diapédèse et de migration6,7,8. À l’heure actuelle, des efforts sont en cours pour trouver des moyens d’améliorer ces étapes. Diverses stratégies, y compris la modification génétique, l’ingénierie de surface cellulaire, l’amorçage in vitro et le guidage magnétique, ont été testées6,7. En outre, plusieurs tentatives ont été faites pour promouvoir la protection et la régénération des cellules ciliées auditives en homing MSCs au site de la cochlée endommagée. Cependant, le suivi des CSM in vivo prend du temps et exige beaucoup de main-d’œuvre et nécessite des compétences hautement spécialisées9.
Pour résoudre ce problème, une méthode a été développée pour observer le homing des CSM dans la cochlée par microscopie confocale time-lapse qui photographie la migration des cellules sur plusieurs heures(Figure 1). Il a été développé au début du 20 e siècle et est récemment devenu un outil puissant pour étudier la migration de cellules spécifiques.
Figure 1: Résumé graphique ( A) Après que l’organe disséqué de Corti est collé sur une lame de couverture en plastique à l’aide d’une pince, la lame de couverture est placée sur une parabole microscopique confocale à fond de verre de 35 mm, et(B)le cylindre de verre est positionné. (C) Après avoir rempli l’intérieur du cylindre de verre avec un milieu, (D) les CSM marqués GFP avec du milieu sont ajoutés soigneusement à l’extérieur du cylindre. (E) Après une nuit d’incubation, (F) le cylindre de verre est retiré et les images sont prises avec un microscope confocal. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; CSM = cellules souches mésenchymateuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transplantation de CSM dans des sites endommagés pour favoriser la régénération des cellules endommagées a été intensivement étudiée, et l’effet thérapeutique est évident. On a rapporté que la transplantation et la différenciation subséquente des CSM rétablissent l’audition chez les rats présentant une perte auditive induite par l’acide 3 nitropropionique13. Bien que Lee et coll. aient appliqué des CSM aux êtres humains de façon transcanadienne, ils n’ont pas obtenu d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) de la National Research Foundation (NRF) de Corée et du Hallym University Research Fund.
Materials
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
Referências
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
