In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Jeong-Eun Park; Su Hoon Lee; Dong Jun Park; Young Joon Seo; Sung  Kyun Kim

doi:10.3791/61947

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Medicina

इन विट्रो टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग कॉर्टी के अंग की ओर सेल माइग्रेशन का पता लगाने के लिए

Published: December 04, 2020

doi:

10.3791/61947

Jeong-Eun Park*^1,2,3, Su Hoon Lee*^1,2, Dong Jun Park², Young Joon Seo², Sung Kyun Kim

¹Department of Otorhinolaryngology,Yonsei University Wonju College of Medicine, ²Research Institute of Hearing Enhancement,Yonsei University Wonju College of Medicine, ³Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Hallym University College of Medicine

Summary

इस अध्ययन में, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक वास्तविक समय इमेजिंग विधि प्रस्तुत करते हैं ताकि पूर्व वीवो इनक्यूबेशन द्वारा कॉर्टी के अंग वाले कॉकलियर एपिथेलियम के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों की ओर बढ़ने वाली कोशिकाओं का निरीक्षण किया जा सके।

Abstract

सेल पुनर्जनन और उपचार पर मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, यह विधि कॉकलियर एपिथेलियम के साथ सह-संस्कृति के बाद एमएससी माइग्रेशन और रूपात्मक परिवर्तनों को ट्रैक करती है। कॉर्टी के अंग को विच्छेदन के दौरान उत्पन्न रिस्नर की झिल्ली के एक हिस्से को दबाकर प्लास्टिक कवरलिप पर स्थिर किया गया था। एक ग्लास सिलेंडर द्वारा सीमित एमएससी जब सिलेंडर हटा दिया गया था कॉकलियर एपिथेलियम की ओर चले गए । उनका प्रमुख स्थानीयकरण कॉर्टी के अंग के मोडिओलस में देखा गया था, जो तंत्रिका फाइबर के समान दिशा में गठबंधन किया गया था। हालांकि, कुछ एमएससी को लिम्बस क्षेत्र में स्थानीयकृत किया गया था और एक क्षैतिज विस्तारित आकार दिखाया गया था। इसके अलावा हेयर सेल एरिया में माइग्रेशन बढ़ा और कानामाइसिन ट्रीटमेंट के बाद एमएससी की मॉर्फोलॉजी विभिन्न रूपों में बदल गई। अंत में, इस अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि कॉकलियर एपिथेलियम के साथ एमएससी की सहसंस्कृति कोशिका प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकित्सीय के विकास के लिए और सेल पुनर्जनन के अध्ययन के लिए उपयोगी होगी जो विभिन्न स्थितियों और कारकों की जांच कर सकती है।

Introduction

सुनवाई हानि सौहार्दपूर्ण ढंग से हो सकती है या उम्र बढ़ने, दवाओं और शोर सहित कई कारकों द्वारा उत्तरोत्तर कारण हो सकती है। श्रवण हानि का इलाज करना अक्सर कठिन होता है क्योंकि एक बार श्रवण के लिए उत्तरदायी बाल कोशिकाओं के क्षतिग्रस्त होने के बाद बिगड़ा कार्य को बहाल करना बहुत चुनौतीपूर्ण होता है¹. विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में ४६१,०,० लोगों को सुनवाई हानि का अनुमान है, जो दुनिया की आबादी का ६.१% के लिए खातों । सुनवाई हानि के साथ उन में से, ९३% वयस्क हैं, और 7% बच्चे हैं ।

कई दृष्टिकोणों को सुनवाई हानि का इलाज करने का प्रयास किया गया है; विशेष रूप से, एमएससी का उपयोग करके एक पुनर्जनन दृष्टिकोण एक आशाजनक उपचार के रूप में उभरा है। जब ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो एमएससी को स्वाभाविक रूप से संचार प्रणाली में छोड़ा जाता है और चोट स्थल पर स्थानांतरित कर दिया जाता है जहां वे विभिन्न अणुओं को एक माइक्रोएनवायरमेंट बनाने के लिए स्रावित करते हैं जो पुनर्जनन²को बढ़ावा देता है। इसलिए,क्षतिग्रस्त कोशिका समारोह^3,^4,⁵की बहाली को बढ़ाने के लिए बाहरी रूप से प्रत्यारोपित एमएससी के प्रवास के माध्यम से क्षतिग्रस्त ऊतकों के इलाज के लिए एक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है जो अंगों को लक्षित करने के लिए और अणुओं के उनके बाद के स्राव का कारण बनता है जो शक्तिशाली प्रतिरक्षा विनियमन, एंजियोजेनेसिस और एंटी-एपोप्टोसिस का कारण बनता है।

होमिंग प्रक्रिया जिसमें एमएससी क्षतिग्रस्त ऊतकों में स्थानांतरित होते हैं, दूर करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बाधा हो सकती है। एमएससी में टेदरिंग/रोलिंग, एक्टिवेशन, गिरफ्तारी,ट्रांसफ्यूजन/डायपेडेसिस और माइग्रेशन^6,^7,⁸के अनुक्रमिक कदमों के साथ एक प्रणालीगत होमिंग तंत्र है । वर्तमान में, इन कदमों को बेहतर बनाने के तरीकों की पहचान करने के प्रयास चल रहे हैं । आनुवंशिक संशोधन, सेल सरफेस इंजीनियरिंग, इन विट्रो प्राइमिंग और चुंबकीय मार्गदर्शन सहित विभिन्न रणनीतियों का परीक्षण किया गया है^6,^7। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त कोचलिया की साइट पर एमएससी होमिंग द्वारा श्रवण बाल कोशिकाओं के संरक्षण और उत्थान को बढ़ावा देने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । हालांकि, वीवो में एमएससी पर नज़र रखने में समय लेने वाली और श्रम-प्रधान है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कौशल⁹की आवश्यकता होती है।

इस समस्या को हल करने के लिए, समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोकलिया में एमएससी के होमिंग का निरीक्षण करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी जो कई घंटों(चित्र 1)से अधिक कोशिकाओं के प्रवास की तस्वीरों को चित्रित करती है। यह 20^वीं शताब्दी की शुरुआत में विकसित किया गया था और हाल ही में विशिष्ट कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है।

चित्र 1:ग्राफिकल सार। (ए)कॉर्टी के विच्छेदित अंग का पालन करने के बाद एक प्लास्टिक कवरलिप पर संदंश का उपयोग करके, कवरस्लिप को 35 मिमी ग्लास-तली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक डिश पर रखा जाता है, और(ख)ग्लास सिलेंडर तैनात किया जाता है। (ग)ग्लास सिलेंडर के अंदर मीडियम भरने के बाद(डी)जीएफपी लेबल वाले एमएससी को मीडियम के साथ सिलेंडर के बाहर सावधानी से जोड़ा जाता है । (ई)रातभर इनक्यूबेशन के बादग्लाससिलेंडर को हटा दिया जाता है, और इमेज को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से लिया जाता है । संक्षिप्त रूप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; MSCs = mesenchymal स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

आईसीआर चूहों से जुड़े सभी शोध प्रोटोकॉल को वोंजू कॉलेज ऑफ मेडिसिन में योनसेई विश्वविद्यालय की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी थी । प्रयोग विश्व चिकित्सा संघ की आचार सं?…

Representative Results

त्रि-आयामी मोड में एमएससी के इन विट्रो माइग्रेशन का मूल्यांकन ट्रांसवेल प्रणाली द्वारा या पारंपरिक घाव उपचार विधि द्वारा दो आयामी (2डी) मोड11में माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए ?…

Discussion

क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए क्षतिग्रस्त स्थलों में एमएससी के प्रत्यारोपण का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और चिकित्सीय प्रभाव स्पष्ट है । 3-नाइट्रोप्रोपोनिक एसिड^1…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) और हैलिम यूनिवर्सिटी रिसर्च फंड से रिसर्च ग्रांट (एनआरएफ-2018-R1D1A1B0705050175, HURF-2017-66) का समर्थन मिला ।

Materials

10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787

Referências

Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).

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Citar este artigo

Park, J., Lee, S. H., Park, D. J., Seo, Y. J., Kim, S. K. In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti. J. Vis. Exp. (166), e61947, doi:10.3791/61947 (2020).