Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

Summary

In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l’epitelio cocleare contenente l’organo di Corti.

Abstract

Per studiare gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (CSC) sulla rigenerazione e sul trattamento cellulare, questo metodo tiene traccia della migrazione MSC e dei cambiamenti morfologici dopo la co-coltura con epitelio cocleare. L’organo di Corti è stato immobilizzato su un coverslip di plastica premendo una porzione della membrana del Reissner generata durante la dissezione. I CSC confinati da un cilindro di vetro migrarono verso l’epitelio cocleare quando il cilindro fu rimosso. La loro localizzazione predominante è stata osservata nel modiolo dell’organo di Corti, allineato in una direzione simile a quella delle fibre nervose. Tuttavia, alcuni CSC erano localizzati nell’area limbus e mostravano una forma allungata orizzontalmente. Inoltre, la migrazione nell’area delle cellule cieche è stata aumentata e la morfologia dei CSC è cambiata in varie forme dopo il trattamento con kanamicina. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che la cocultura dei CSC con epitelio cocleare sarà utile per lo sviluppo di terapie attraverso il trapianto cellulare e per studi di rigenerazione cellulare in grado di esaminare varie condizioni e fattori.

Introduction

La perdita dell’udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell’udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell’udito sono^{danneggiate 1}. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.

Sono stati tentati diversi approcci per trattare la perdita dell’udito; in particolare, un approccio di rigenerazione che utilizza i CTC è emerso come un trattamento promettente. Quando il tessuto è danneggiato, i CSC vengono naturalmente rilasciati nel sistema circolatorio e migrano verso il sito della lesione dove secernono varie molecole per formare un microambiente che promuove la^{rigenerazione 2}. Pertanto, è importante sviluppare un metodo per trattare i tessuti danneggiati attraverso la migrazione dei CBC impiantati esternamente agli organi bersaglio e la loro successiva secrezione di molecole che causano una potente regolazione immunitaria, angiogenesi e anti-apoptosi per migliorare il ripristino della funzione^{cellulare danneggiata 3,4,5}.

Il processo di homing in cui i CSC migrano verso tessuti danneggiati può essere l’ostacolo più importante da superare. Gli MSC hanno un meccanismo sistemico di homing con passaggi sequenziali di tethering/rolling, attivazione, arresto, trasmigrazione/diapedesi e migrazione^6,7,8. Attualmente sono in corso sforzi per individuare modi per migliorare questi passaggi. Varie strategie, tra cui la modificazione genetica, l’ingegneria delle superfici cellulari, l’adescamento in vitro e la guida magnetica,^{sono state testate 6,7}. Inoltre, sono stati fatti diversi tentativi per promuovere la protezione e la rigenerazione delle cellule ciliate uditivi affinando i CTC nel sito della coclea danneggiata. Tuttavia, tenere traccia dei CSC in vivo richiede molto tempo e manodopera e richiede competenze altamente specializzate⁹.

Per risolvere questo problema, è stato messo a punto un metodo per osservare l’affinamento dei CFC nella coclizione attraverso la microscopia confocale time-lapse che fotografa la migrazione delle cellule per diverse ore (Figura 1). È stato sviluppato all’inizio del XX secolo^ed è recentemente diventato un potente strumento per studiare la migrazione di cellule specifiche.

Figura 1: Astratto grafico. (A) Dopo che l’organo sezionato di Corti è stato aderito su un copripasta di plastica con forcep, il copripasta viene posizionato su un piatto microscopico confocale con fondo di vetro da 35 mm e (B) il cilindro di vetro è posizionato. (C) Dopo aver riempito l’interno del cilindro di vetro con CCC con etichetta GFP media,(D)con mezzo vengono aggiunti con attenzione all’esterno del cilindro. (E) Dopo l’incubazione durante la notte,(F)il cilindro di vetro viene rimosso e le immagini vengono scattate con un microscopio confocale. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC = cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua. 1. Dissezione delle cocche Sterilizzare la cappa di coltura del…

Representative Results

La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L’organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiola…

Discussion

Il trapianto di MBC in siti danneggiati per promuovere la rigenerazione delle cellule danneggiate è stato ampiamente studiato e l’effetto terapeutico è evidente. Il trapianto e la successiva differenziazione dei CSC sono stati segnalati per ripristinare l’udito nei ratti con perdita dell’udito indotta da acido 3-nitropropionico¹³. Sebbene Lee et al. Fino a poco tempo fa, quasi 12 esperimenti sono stati condotti per ripristinare l’udito nel modello di roditore mediante tra…

Materials

10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787