توليف الدورة الحلقية غير المتجانسة الوظيفية وفحص السمية الخلوية
Summary
هنا ، نصف مقايسة حيوية باستخدام 3- (4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl) -2,5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) لاختبار الأوكسيم الحلقية المركبة مسبقا.
Abstract
تم الإبلاغ مؤخرا عن الدورات الحلقية الحلقية في الأدبيات لتكون أدوية محتملة لعلاج السرطان. إن توليف أنظمة الحلقات المتعامدة الجديدة هذه يمثل تحديا. تم مؤخرا نشر منهجية فعالة لتجميع هذه المركبات وصفت تخليق المرحلة الصلبة في أربع خطوات بدلا من الخطوات الخمس المبلغ عنها سابقا. ميزة هذا التوليف الأقصر هي القضاء على استخدام الكواشف السامة. تم العثور على راتنج مايكل المتجدد منخفض التحميل (REM) القائم على الرابط ليكون حاسما في التوليف حيث منعت الإصدارات عالية التحميل إضافة الكواشف التي تحتوي على فينيل ضخم وسلاسل جانبية عطرية. تم استخدام مقايسة القياس اللوني 3- (4′,5′-ثنائي ميثيل ثيازول-2′-يل)-2,5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) لفحص السمية الخلوية لتركيزات الميكرومولار لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة في المختبر. MTT متاح بسهولة تجاريا وينتج نتائج سريعة وموثوقة نسبيا ، مما يجعل هذا الاختبار مثاليا لهذه الدورات الحلقية هذه. تم اختبار هياكل الحلقة المتعامدة وكذلك furfurylamine (مقدمة في طريقة التوليف تحتوي على شكل حلقة مماثل مكون من 5 أعضاء).
Introduction
من المعروف أن تثبيط الجزيئات الصغيرة لتفاعل E3 ubiquitin-ligase الماوس مزدوج الدقيقة 2 متماثل (MDM2) مع p53 لاستعادة الحث بوساطة p53 لموت الخلايا المبرمجللخلايا السرطانية 1،2،3. MDM2 هو منظم سلبي لمسار p53 وغالبا ما يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا السرطانية4،5،6،7،8،9. كشفت الدراسات البلورية والكيميائية الحيوية الحديثة أن الجزيئات الصغيرة التي تحتوي على إطار حلزوني يمكن أن تمنع بشكل فعال تفاعلات MDM2-p5310. يعتبر الإطار الحلقية الحلقية (الشكل 1 ، مظلل باللون الأزرق) فكرة مميزة حيث أدى اشتقاق نظام الحلقة المتعامدة الصلب هذا إلى اكتشاف عقاقير علاجية جديدة. يشكل الوصول إلى هذه البنية المثيرة للاهتمام تحديا عند استخدام تقنيات التخليق العضوي التقليدية. على الرغم من أن التأثيرات العلاجية للجزيئات الحلقية الحلقية في الأنظمة البيولوجية قد تم التحقيق فيها ، إلا أن تخليق هذه الجزيئات لا يزال عملية مرهقة. غالبا ما تكون المنتجات الجانبية غير المرغوب فيها ، التي تستخدم ظروفا قاسية ، والمعادن الانتقالية الخطرة مشكلة.
أدى الاستخدام المحتمل للشكل الحلقية الحلقية في تطوير الأدوية إلى تطوير بروتوكول يستخدم تخليق الطور الصلب لإنشاء مكتبة من الجزيئات مع الشكل بالإضافة إلى مجموعات وظيفية أخرى قابلة للتبديل11,12. يمكن تحقيق فصل المنتجات والمواد المتفاعلة بين الخطوات ببساطة عن طريق استخدام رابط REM متصل بحبة راتنجية ووعاء ترشيح صلب الطور. هذا من شأنه أن يقلل من الخطوات وربما يزيد الغلة. يمكن أن ينتج هذا النهج الاصطناعي مجموعة كبيرة من الأدوية المرشحة المحتملة. ومع ذلك ، فإن فعالية هذه الجزيئات في النظام البيولوجي تتطلب مزيدا من التحقيق.
لتحديد السمية الخلوية لهذه المركبات الحلقية الحلقية ، تم استخدام اختبار MTT13,14. تقيس هذه الطريقة صلاحية الخلية ويمكن استخدامها لتحديد السمية الخلوية بشكل غير مباشر. تمت إضافة تركيزات مختلفة من المثبطات إلى الخلايا المستزرعة في صفيحة 96 بئرا ، وتم قياس نسبة الخلايا الحية عن طريق التحليل اللوني لمدى اختزال MTT الأصفر بواسطة نازعة هيدروجين الميتوكوندريا إلى مركب الفورمازان الأرجواني (الشكل 2). غالبا ما يتم الإبلاغ عن النشاط كقيمة IC 50 – التركيز الذي يتم عنده تثبيط نمو الخلايا بنسبة50٪ بالنسبة إلى عنصر تحكم غير معالج. تصف هذه الورقة بروتوكول مقايسة MTT والنتائج الأولية لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
استند تخليق المركبات الحلقية الحلقية إلى الأبحاث السابقة التي أجراها هذا المختبر ، ولكن مع بعض التعديلات (الشكل 1)11,12. تمت مراقبة تقدم كل خطوة تفاعل بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. إضافة مايكل لرابط REM 1 مع فورفور?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مجلس أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى KSH (مكتب البحوث والمنح ، جامعة أزوسا باسيفيك – الولايات المتحدة الأمريكية). A.N.G. و J.F.M. حاصلان على زمالة الخبرة البحثية العلمية الجامعية (SURE). S.K.M. و B.M.R. حاصلان على منح زمالة أبحاث العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (مركز البحوث في العلوم ، جامعة أزوسا باسيفيك – الولايات المتحدة الأمريكية). نحن ممتنون للدكتور ماثيو بيريزوك والدكتور فيليب كوكس للحصول على إرشادات حول المقايسات الحيوية.
Materials
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
Referências
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)
