हम नीले पूंछ वाले डैमसेल्फली(इस्चनुरा सेनेगलःज़िगोप्टेरा) और पिएड स्किमर ड्रैगनफ्लाई(स्यूडोथेमिस ज़ोनटा:लिबेलुलीडी: एनिसोपेरा) का उपयोग करके आदेश ओडोनाटा (ड्रैगनफ्लियों और डैमफ्लियों) की कीड़ों में इलेक्ट्रोपॉशन-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
ड्रैगनफ्लियों और डैमेफ्लियों (ऑर्डर ओडोनाटा) कायापलट के साथ सबसे पैतृक कीड़ों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें वे अपने आवास, आकृति विज्ञान और व्यवहार को जलीय लार्वा से प्यूपल चरण के बिना स्थलीय/हवाई वयस्कों में काफी बदलते हैं। ओडोनाटा वयस्कों के पास एक अच्छी तरह से विकसित रंग दृष्टि होती है और लिंगों, चरणों और प्रजातियों में शरीर के रंगों और पैटर्न में उल्लेखनीय विविधता दिखाती है। जबकि ओडोनाटा पर कई पारिस्थितिक और व्यवहार अध्ययन किए गए हैं, आणविक आनुवंशिक अध्ययन मुख्य रूप से ओडोनाटा में जीन कार्यात्मक विश्लेषण लागू करने में कठिनाई के कारण दुर्लभ रहे हैं। उदाहरण के लिए, 1000 में ओडोनाटा में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) कम प्रभावी है, जैसा कि लेपिडोप्टेरा में बताया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने वीवो इलेक्ट्रोपॉरेशन में संयुक्त रूप से एक आरएनएआई विधि की सफलतापूर्वक स्थापना की। यहां हम इलेक्ट्रोपाउशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि का एक वीडियो सहित एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं: लार्वा की तैयारी, प्रजातियों की पहचान, dsRNA/सिरना समाधान और इंजेक्शन सुई की तैयारी, लार्वा की बर्फ-ठंड संज्ञाहरण, dsRNA/सिराना इंजेक्शन, वीवो इलेक्ट्रोपॉरेशन में, और वयस्क उद्भव तक व्यक्तिगत पालन । इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि दोनों डैमेजफ्लियों (सबऑर्डर ज़िगोप्टेरा) और ड्रैगनफ्लियों (सबऑर्डर एनिसोप्टेरा) पर लागू होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम ब्लू-पूंछ वाले डैमसेल्फली इस्चनुरा सेनेगल (कोएनग्रिओनिडी) के लिए डीमसेल्फली प्रजातियों और पिड स्किमर ड्रैगनफ्लाई स्यूथेमिस ज़ोनटा (लिबेलुलिडे) के लिए ड्रैगनफ्लाई प्रजातियों के एक अन्य उदाहरण के रूप में तरीके प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम आरएनएआई के परिणामों को दिखाते हैं जो मेलेनिन संश्लेषण जीन मल्टीकॉपर ऑक्सीडेस 2को लक्षित करते हैं। यह आरएनएआई विधि कायापलट, मॉर्फोजेनेसिस, रंग पैटर्न गठन और ओडोनाटा की अन्य जैविक विशेषताओं में शामिल विभिन्न जीन कार्यों की समझ को सुगम बनाएगी। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल आम तौर पर गैर-मॉडल जीवों पर लागू हो सकता है जिसमें आरएनएआई अक्षमता और कम पेनेट्रेंस के कारण जीन दमन में कम प्रभावी है।
ड्रैगनफ्लियों और डैमेफ्लियों (ऑर्डर ओडोनाटा) कीड़ों के सबसे पैतृक समूहों में से हैं जो “कायापलट”1, 2प्रदर्शितकरतेहैं। कायापलट से, वे जलीय लार्वा से अपने आवास, आकृति विज्ञान और व्यवहार को काफी हद तक बदलतेहैं। ओडोनाटा वयस्कों के पास एक अच्छी तरह से विकसित रंग दृष्टि होती है और लिंगों,चरणों और प्रजातियों3,4,5में शरीर के रंगों और पैटर्न में उल्लेखनीय विविधता का प्रतिनिधित्व करती है। जबकि ओडोनाटा पर कई पारिस्थितिक और व्यवहार अध्ययन आयोजित किए गए हैं6,7,आणविक आनुवंशिक अध्ययन मुख्य रूप से ओडोनाटा में जीन कार्यात्मक विश्लेषण लागू करने में कठिनाई से बाधित हुए हैं।
पारंपरिक आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) विधि, जिसमें डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को ब्याज8के जीन के कार्य को दबाने के लिए इंजेक्ट किया जाता है, ओडोनाटा कीड़े9में अप्रभावी हो गया, जैसा कि लेपिडोपटेरन कीड़े10में बताया गया है। दूसरी ओर, पिछली रिपोर्टों में सुझाव दिया गया है कि इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई लेपिडोपटेरन प्रजातियों में प्रभावी है, विशेष रूप से एपिडर्मल ऊतकों में11,12,13। हमने हाल ही में पाया कि इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई छोटे ड्रैगनफ्लाई नानोफिया पिगमैया (लिबेलुलाइटी: एनिसोपेरा) 9 में प्रभावीढंगसे काम करता है, लेकिन एन पिगमैया एक अपेक्षाकृत दुर्लभ प्रजाति है और इसलिए आणविक आनुवंशिक अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है।
अधिकांश ओडोनाटा प्रजातियों को दो उप-आदेशों में से किसी में वर्गीकृत किया जाता है, ज़िगोप्टेरा (डैमेफ्लियों) या एनिसोपेरा (ट्रू ड्रैगनफ्लियों)3। यहां हमने नीली पूंछ वाले डैमसेल्फली इस्चनुरा सेनेगल (कोएनग्रिओनिडी) पर ध्यान केंद्रित किया; चित्रा 1A) एक प्रतिनिधि के रूप में ज़िगोप्टरन प्रजातियों और पिड स्किमर ड्रैगनफ्लाई स्यूडोथेमिस ज़ोनटा (लिबेलुलिडी; चित्रा 1B) एक प्रतिनिधि अनीसोपटेरन प्रजातियों के रूप में। दो प्रजातियां जापान में प्राकृतिक और शहरी तालाबों में सबसे आम ओडोनाटा प्रजातियों में से हैं, जिनमें त्सुकुबा शहर के लोग शामिल हैं, और हम क्षेत्र में दो प्रजातियों के कई लार्वा एकत्र कर सकते हैं । हाल ही में हमने आई सेनेगलकेअलग – अलग लार्वा के लिए एक प्रयोगशाला पालन प्रणाली स्थापित की, जिसने ओडोनाटा लार्वा के विकास और मॉर्फोजेनेसिस की निरंतर निगरानी14में सक्षम की ।
इस रिपोर्ट में, हम आई सेनेगलेंसिस और पी ज़ोनटा में इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई के लिए एक परिष्कृत विधि और एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। जापान में, आई सेनेगलेंसिस और इशुनुरा एशियाटिका,जो आनुवंशिक रूप से करीब हैं, अक्सर15सहजरूप से पाए जाते हैं, और उन्हें लार्वा16में अंतर करना मुश्किल होता है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे दो इस्चनुरा प्रजातियों को प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
इलेक्ट्रोपॉर्मेशन-मध्यस्थता आरएनएआई की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हम जीन अभिव्यक्ति 9 के नॉकआउट पर पालर क्यूटिकल रंग के दृश्यमान फेनोटाइप के कारण, एक प्रतिनिधि लक्ष्य जीन के रूप में मल्टीकॉपर ऑक्सीडेस 2 जीन(MCO2,जिसे लैक्केस 2के रूप में भी जानाजाताहै) का चयन करते हैं। 17,18कीट प्रजातियों की एक किस्म में एपिडर्मिस के अंधेरे के लिए MCO2 को आवश्यक मानाजाताहै ।
आरएनएआई उपचार की घातकता
हमने पाया कि आरएनएआई उपचार की घातकता ओडोनाटा लार्वा के पालन इतिहास और स्थिति पर दृढ़ता से निर्भर करती है। क्षेत्र में संग्रह के तुरंत बाद लार्वा आम तौर पर स्वस्थ होते हैं और इलेक्ट्रोपाउरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई उपचार के बाद कम मृत्यु दर प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, प्रयोगशाला में लंबे समय तक पाला गया लार्वा (उदाहरण के लिए, एक महीने) वयस्क उद्भव की कम सफलता दर ों को पीड़ित करता है। I. सेनेगलमें, खेत में एकत्र लार्वा के बजाय, अंडों से प्रयोगशाला में पाले गए लार्वा का उपयोग14किया जा सकता है, लेकिन प्रयोगशाला-पाला लार्वा का उपयोग करके आरएनएआई की सफलता दर काफी कम हो जाती है (क्षेत्र-एकत्र लार्वा का उपयोग करने वालों की तुलना में कई व्यक्ति कायापलट के दौरान मर गए)। इसके अलावा, वयस्क उद्भव की सफलता दरों को बढ़ाने और आरएनएआई उपचार की घातकता को कम करने के लिए लगातार लार्वा खिलाने और स्वच्छ पानी पालन महत्वपूर्ण हैं।
आरएनएआई उपचार की दक्षता
जैसा कि ऊपर वर्णित है, आरएनएआई फेनोटाइप के स्तर, अर्थात् क्यूटिकल डिकोलोराइजेशन के आकार और स्थान, अक्सर एक ही आरएनएआई उपचार (जैसे, चित्रा 4)के अधीन व्यक्तियों के बीच काफी भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, लेकिन फेनोटा प्रजाति के बीच फेनोटापिक पेनेट्रान्स का स्तर उल्लेखनीय रूप से अलग लगता है। मनाया गया फेनोटाइपिक क्षेत्र 1. सेनेगल (आंकड़े 4-5)में पी ज़ोनटा (चित्र 6)और एन पिगमैया9की तुलना में अधिक प्रमुख थे। यह अंतर लार्वा की सतह पर क्यूटिकल की मोटाई के कारण हो सकता है, यह देखते हुए कि आई सेनेगलनेसिस का क्यूटिकल पी ज़ोनटा और एन पिग्मेयाके क्यूटिकल से पतला है)। जहां तक हमने जांच की, सिरना और डीएसआरएनए(चित्रा 4, तालिका 1)के प्रभावों के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं पहचाना गया था।
आरएनएआई के लिए उपयुक्त विकासात्मक चरण
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनएआई को कुशलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए उचित लार्वा मंचन महत्वपूर्ण है। वयस्क पिगमेंटेशन का अवरोध चरण डी (वयस्क उद्भव से लगभग 3 दिन पहले) से पहले MCO2 RNAi द्वारा किया गया था, जो एन पिगमैया9पर पिछली रिपोर्ट के अनुरूप है। RNAi फेनोटाइप जब चरणों में इंजेक्शन सी और डी चरणों ए और बी, जो संकेत मिलता है कि सी और डी बहुत देर हो सकती है जीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए इलाज की तुलना में कम विशिष्ट थे मनाया । आरएनएआई उपचार के लिए उपयुक्त समय जीन अभिव्यक्ति के समय पर निर्भर करता है, और MCO2 जीन वयस्क उद्भव9के दौरान क्षणिक रूप से उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है, जैसा कि अन्य कीड़ोंमें 17,18। बदबूदार पलोटिया स्टैलीमें, MCO2 जीन का आरएनएआई नॉकडाउन इंजेक्शन27के बाद 4 दिन से मनाया गया, जो वर्तमान परिणामों के अनुरूप है।
I. सेनेगल्सिस पर हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि, चरण बी के बाद, वयस्क उद्भव के दिनों में अंतिम इंस्टार लार्वा के बहुमत के बीच अपेक्षाकृत छोटे बदलाव प्रदर्शित होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि चरण बी वयस्क उद्भव की ओर प्रक्रिया की शुरुआत के अनुरूप हो सकता है, जिसके बाद कायापलट के लिए विकासात्मक प्रक्रियाएं पूर्वनिर्धारित और समन्वित तरीके से आगे बढ़ती हैं14। घावों के कारण होने वाली रूपात्मक असामान्यताएं अक्सर देखी जाती थीं जब लार्वा को सी और डी(चित्रा 7 बी, 7सी) चरणों में आरएनएआई-उपचारित किया जाताथा। यह इन चरणों के दौरान कायापलट की एक नाटकीय प्रगति के साथ जुड़े होने की संभावना है, सुझाव है कि आरएनएआई उपचार सी और पर चरण से बचा जाना चाहिए । संक्षेप में, हम अनुशंसा करते हैं कि चरण ए या बी (या लार्वा पंखों के काफी विस्तार से पहले चरण में) अंतिम इंस्टार लार्वा का उपयोग आरएनएआई प्रयोगों के लिए किया जाना चाहिए।
इलेक्ट्रोपाउशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि की उपयोगिता और श्रेष्ठता
पारंपरिक आरएनएआई एक सरल और शक्तिशाली प्रयोगात्मक विधि है, लेकिन तितलियों10,एफिड्स28 और ड्रैगनफ्लियों जैसे कुछ कीट वंशकम आरएनएआई दक्षता प्रदर्शित करते हैं, जिसके लिए जीन फ़ंक्शन विश्लेषण की स्थापना एक बड़ी चुनौती है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि इलेक्ट्रोपॉर्मेशन-मध्यस्थता आरएनएआई लगभग 100% दक्षता के साथ ड्रैगनफ्लियों में स्थानीय जीन दमन को प्रेरित कर सकता है, कम से कम एपिडर्मिस में, यदि उचित विकासात्मक चरणों(तालिका 1)पर इलाज किया जाता है। हाल ही में, CRISPR/Cas9 आधारित जीन नॉकआउट सफलतापूर्वक कीड़ों की एक किस्म के लिए लागू किया गया है, गैर मॉडल जीवों के लिए एक शक्तिशाली आणविक आनुवंशिक उपकरण प्रदान29। यहां, तथापि, हम बताते है कि CRISPR/Cas9 निश्चित रूप से महान है, लेकिन इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता RNAi विधि कुछ मामलों में CRISPR/Cas9 से बेहतर हो सकता है ।
सबसे पहले, इलेक्ट्रोपॉन्स्ट्रेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि में, शरीर क्षेत्र जहां आरएनएआई फेनोटाइप दिखाई देते हैं, को इलेक्ट्रोपॉरेशन पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति द्वारा प्रयोगात्मक रूप से आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि जिस क्षेत्र में जीन अभिव्यक्ति को दबाया जाता है, वह उस क्षेत्र के आसपास सीमित है जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखा गया था, आरएनएआई फेनोटाइप की तुलना एक ही व्यक्ति में नियंत्रण फेनोटाइप के साथ आसानी से की जा सकती है। दूसरे, CRISPR/Cas9 विधि की तुलना में जिसमें इंजेक्शन अंडे को नॉकआउट फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए वयस्कता के लिए पाला जाना पड़ता है, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई बेहतर है कि जीन नॉकडाउन फेनोटाइप आमतौर पर बहुत कम समय में देखा जा सकता है । उदाहरण के लिए, आई सेनेगल के लिए तीन से चार महीने और पी ज़ोनाटा के लिए अंडे से वयस्कों के लिए एक से दो वर्ष का समय लगता है14,30। हालांकि, वयस्क एपिडर्मिस के भीतर आरएनएआई फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए, डीस्आरएनए इंजेक्शन से स्टेज बी में अंतिम इंस्टार लार्वा में एक महीने से भी कम समय लगता है, जो आई सेनेगलेंसिस और पी ज़ोनटा (चित्रा 7)दोनों के लिए वयस्क उद्भव के लिए है। तीसरा, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि में बड़े लार्वा में डीएसआरएनए इंजेक्शन पर जोर देता है, जो CRISPR/Cas9 विधि के लिए आवश्यक छोटे अंडों में माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में आसान है । इसके अलावा, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई कीट प्रजातियों पर लागू होता है जिनके नए रखे अंडे एकत्र करना मुश्किल होता है। उदाहरण के लिए, पी ज़ोनाटा की महिलाएं उड़ान के दौरान पानी की सतह पर तैरते पौधों पर अंडे डालती हैं, और इस प्रकार क्षेत्र और प्रयोगशाला दोनों में अपने अंडे एकत्र करना मुश्किल होता है। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल आम तौर पर गैर-मॉडल जीवों पर लागू हो सकता है जिसमें पारंपरिक आरएनएआई विधि कुशलता से काम नहीं करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सलाह और समर्थन के लिए मिनोरू मोरियामा को धन्यवाद देते हैं, बिन हिरोटा और रयुतारो सुजुकी ओडोनाटा लार्वा इकट्ठा करने के लिए, और पांडुलिपि पर सहायक टिप्पणियों के लिए मीसा शिन्या। इस काम को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर JP18J21561 से गो और JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 और JP20H04936 से आरएफ को समर्थन मिला ।
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |