Proporcionamos un protocolo detallado para la interferencia de ARN mediado por electroporación en insectos de la orden Odonata (libélulas y damiselas) utilizando la presa de cola azul (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) y la libélula pied skimmer libélula (Pseudothe zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Las libélulas y las damiselas (orden Odonata) representan uno de los insectos más ancestrales con metamorfosis, en el que cambian su hábitat, morfología y comportamiento drásticamente de larvas acuáticas a adultos terrestres/aéreos sin estadio pupal. Los adultos Odonata tienen una visión de color bien desarrollada y muestran una notable diversidad en los colores y patrones del cuerpo a través de sexos, etapas y especies. Si bien se han realizado muchos estudios ecológicos y conductuales sobre Odonata, los estudios genéticos moleculares han sido escasos principalmente debido a la dificultad para aplicar el análisis funcional géne genético a Odonata. Por ejemplo, la interferencia de ARN (ARN) es menos eficaz en la Odonata, como se indica en el Lepidoptera. Para superar este problema, establecimos con éxito un método RNAi combinado con la electroporación in vivo. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que incluye un video del método RNAi mediado por electroporación de la siguiente manera: preparación de larvas, identificación de especies, preparación de solución de dsRNA/siRNA y agujas de inyección, anestesia helada de larvas, inyección de ARN/SIRNA, electroporación in vivo y rearme individual hasta la aparición de adultos. El método RNAi mediado por electroporación es aplicable tanto a las presas (suborden Zygoptera) como a las libélulas (suborden Anisoptera). En este protocolo, presentamos los métodos para la damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) como ejemplo de especies de damselfly y la libélula pied skifly Pseudothemis zonata (Libellulidae) como otro ejemplo de especies de libélulas. Como ejemplos representativos, mostramos los resultados del ARNi dirigido al gen de síntesis de melanina multicopper oxidasa 2. Este método RNAi facilitará la comprensión de varias funciones génicas implicadas en la metamorfosis, la morfogénesis, la formación de patrones de color y otras características biológicas de Odonata. Además, este protocolo puede ser generalmente aplicable a organismos no modelo en los que el ARNi es menos eficaz en la supresión de genes debido a la ineficiencia y baja penetración.
Las libélulas y las damiselas (el orden Odonata) se encuentran entre los grupos más ancestrales de insectos que exhiben “metamorfosis”1,2. Por metamorfosis, cambian su hábitat, morfología y comportamiento drásticamente de larvas acuáticas a adultos terrestres/aéreos3. Los adultos Odonata tienen una visión de color bien desarrollada y representan una notable diversidad en los colores y patrones del cuerpo a través de sexos, etapas y especies3,4,5. Si bien muchos estudios ecológicos y conductuales sobre Odonata se han realizado6,7, los estudios genéticos moleculares se han visto obstaculizados principalmente por la dificultad para aplicar el análisis funcional del gen a Odonata.
El método de interferencia de ARN convencional (ARNI), en el que se inyecta ARN de doble cadena (dsRNA) para suprimir la función del gen de interés8,resultó ser ineficaz en los insectos Odonata9,como se indica en los insectos Lepidopteran10. Por otro lado, informes anteriores han sugerido que el RNAi mediado por la electroporación es eficaz en las especies de lepidópteros, especialmente en los tejidos epidérmicos11,12,13. Recientemente descubrimos que el ARNi mediado por electroporación funciona eficazmente en la diminuta libélula Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, pero N. pygmaea es una especie relativamente rara y por lo tanto no es adecuada para estudios genéticos moleculares.
La mayoría de las especies de Odonata se clasifican en cualquiera de los dos subordenes, Zygoptera (damselflies) o Anisoptera (verdaderas libélulas)3. Aquí nos centramos en la presa de cola azul Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figura 1A) como una especie representativa de Zygopteran y el pied skifly libélula Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figura 1B) como una especie representativa de Anisopteran. Las dos especies se encuentran entre las especies Odonata más comunes en estanques naturales y urbanos en Japón, incluyendo las de la ciudad de Tsukuba, y podemos recolectar muchas larvas de las dos especies en el campo. Recientemente establecimos un sistema de cría de laboratorio para larvas individuales de I. senegalensis,que permitió el seguimiento continuo del desarrollo y la morfogénesis de las larvas de Odonata en detalle14.
En este informe, proporcionamos un método refinado y un protocolo de video para el RNAi mediado por electroporación en I. senegalensis y P. zonata. En Japón, I. senegalensis e Ischnura asiatica,que están genéticamente cerca, a menudo se encuentran simpáticamente15, y son difíciles de distinguir en las larvas16. También describimos cómo dos especies de Ischnura se pueden distinguir por el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).
Para evaluar la eficacia del RNAi mediado por electroporación, seleccionamos el gen multicopper oxidasa 2 (MCO2; también conocido como laccase2) como un gen objetivo representativo, debido al fenotipo visible de color de cutícula más pálido al derribar la expresión génica9. MCO2 es conocido por ser esencial para el oscurecimiento de la epidermis en una variedad de especies de insectos17,18.
Letalidad del tratamiento con ARNi
Encontramos que la letalidad del tratamiento con ARNi depende en gran medida de la historia de la crianza y el estado de las larvas de Odonata. Las larvas poco después de la recolección en el campo son generalmente saludables y exhiben bajas tasas de mortalidad después del tratamiento de ARNi mediado por electroporación. Por el contrario, las larvas criadas en el laboratorio durante un largo período de tiempo (por ejemplo, un mes) tienden a sufrir bajas tasas de éxito de aparición de adultos. En I. senegalensis,en lugar de las larvas recogidas en el campo, las larvas criadas en el laboratorio a partir de huevos se pueden utilizar14, pero las tasas de éxito de ARNi utilizando las larvas criadas en laboratorio tienden a ser considerablemente más bajas (muchos individuos murieron durante la metamorfosis) que los que utilizan las larvas recogidas en el campo. Además, la alimentación larvaria frecuente y la cría de agua limpia son importantes para aumentar las tasas de éxito de la aparición de adultos y reducir la letalidad del tratamiento con ARNi.
Eficiencia del tratamiento con ARNi
Como se describió anteriormente, los niveles de fenotipo de ARNi, a saber, el tamaño y la ubicación de la decoloración de la cutícula, a menudo presentaban variaciones considerables entre los individuos sometidos al mismo tratamiento de ARNi (por ejemplo, la Figura 4),pero los niveles de la penetración fenotípica parecen ser notablemente diferentes entre la especie Odonata. Las regiones fenotípicas observadas fueron más grandes y prominentes en I. senegalensis (Figuras 4-5) que en P. zonata (Figura 6) y N. pygmaea9. Esta diferencia puede deberse al grosor de la cutícula en la superficie larvaria, teniendo en cuenta que la cutícula de I. senegalensis es más delgada que la cutícula de P. zonata y N. pygmaea). Por lo que examinamos, no se reconoció una diferencia clara entre los efectos del ARNr y el ARS (Figura 4, Tabla 1).
Etapa de desarrollo adecuada para el ARNi
Cabe señalar que la estadificación larvaria adecuada es importante para realizar el ARNi de manera eficiente. La inhibición de la pigmentación adulta fue causada por EL ARNi MCO2 antes de la etapa D (aproximadamente 3 días antes de la aparición de adultos), lo que es consistente con el informe anterior sobre N. pygmaea9. Los fenotipos de ARNi observados cuando se inyectaban en las etapas C y D eran menos visibles que los tratados en las etapas A y B, lo que indica que las etapas C y D pueden ser demasiado tardes para suprimir suficientemente la expresión génica. El momento adecuado para el tratamiento con ARNi depende del momento de la expresión génica, y el gen MCO2 exhibe una expresión significativamente alta durante la aparición adulta9, como en otros insectos17,18. En el apestoso Plautia stali, RNAi derribo del gen MCO2 se observó desde el día 4 en adelante después de la inyección27, que es consistente con los resultados actuales.
Nuestro estudio previo sobre I. senegalensis mostró que, después de la etapa B, los días a la aparición adulta exhiben variaciones relativamente pequeñas entre la mayoría de las larvas instar finales, lo que sugiere que la etapa B puede corresponder al inicio del proceso hacia la aparición adulta, después de lo cual los procesos de desarrollo para la metamorfosis proceden de manera prefijada y coordinada14. A menudo se observaron anomalías morfológicas causadas por heridas cuando las larvas fueron tratadas con ARNi en las etapas C y D (Figura 7B, 7C). Es probable que esto se asocie con una progresión dramática de la metamorfosis durante estas etapas, lo que sugiere que el tratamiento con ARNI debe evitarse desde la etapa C y en. En resumen, recomendamos que las larvas instar finales en la etapa A o B (o en la etapa antes de que las alas larvales se expandan significativamente) se utilicen para experimentos con ARNi.
Utilidad y superioridad del método de ARNi mediado por electroporación
El RNAi convencional es un método experimental simple y potente, pero algunos linajes de insectos como las mariposas10,los áfidos28 y las libélulas9 exhiben una baja eficiencia de ARNi, para lo cual el establecimiento del análisis de la función génica es un desafío importante. En este estudio, encontramos que el ARNi mediado por la electroporación puede inducir la supresión del gen local en libélulas con casi 100% de eficiencia, al menos en epidermis, si se trata en etapas de desarrollo apropiadas (Tabla 1). Recientemente, los nocauts genéticos basados en CRISPR/Cas9 se han aplicado con éxito a una variedad de insectos, proporcionando una poderosa herramienta genética molecular para organismos no modelo29. Aquí, sin embargo, señalamos que CRISPR/Cas9 es ciertamente grande, pero el método RNAi mediado por electroporación puede ser superior a CRISPR/Cas9 en algunos aspectos.
En primer lugar, en el método RNAi mediado por electroporación, la región del cuerpo donde aparecen los fenotipos de ARNi puede controlarse fácilmente experimentalmente por la posición del electrodo positivo tras la electroporación. Además, dado que la región donde se suprime la expresión génica está limitada en toda la región donde se colocó el electrodo positivo, los fenotipos de ARNi se pueden comparar fácilmente con los fenotipos de control uno al lado del otro en el mismo individuo. En segundo lugar, en comparación con el método CRISPR/Cas9 en el que los huevos inyectados tienen que ser criados hasta la edad adulta para observar los fenotipos knockout, el ARNI mediado por electroporación es superior en el tiempo que los fenotipos de derribo del gen generalmente se pueden observar en un tiempo mucho más corto. Por ejemplo, I. senegalensis tarda de tres a cuatro meses y para P. zonata de huevos a adultos14,30. Sin embargo, para observar fenotipos de ARNi dentro de la epidermis adulta, se tarda menos de un mes desde la inyección de dsRNA en larvas instar finales en la etapa B hasta la aparición adulta tanto para I. senegalensis como para P. zonata (Figura 7). En tercer lugar, el método RNAi mediado por electroporación implica la inyección de ARNrna en larvas grandes, que es más fácil que la microinyección en huevos diminutos necesarios para el método CRISPR/Cas9. Además, el ARNi mediado por la electroporación es aplicable a las especies de insectos cuyos huevos recién puestos son difíciles de recolectar. Por ejemplo, las hembras de P. zonata ponen huevos sobre plantas flotantes sobre la superficie del agua durante el vuelo, y por lo tanto es difícil recoger sus huevos tanto en el campo como en el laboratorio. Por lo tanto, esperamos que este protocolo pueda ser generalmente aplicable a organismos no modelo en los que el método RNAi convencional no funciona de manera eficiente.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Minoru Moriyama por asesoramiento técnico y apoyos, Bin Hirota y Ryutaro Suzuki por recoger larvas de Odonata, y Misa Shinya por comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 to GO y JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 y JP20H04936 a RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |