Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för elektroporation-medierad RNA-interferens hos insekter av ordningen Odonata (trollsländor och damselflies) med hjälp av den blåstjärtade damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) och pied skimmer trollslända (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Trollsländor och damselflies (ordning Odonata) representerar en av de mest förfädernas insekter med metamorfos, där de ändrar sin livsmiljö, morfologi och beteende drastiskt från vattenlevande larver till landlevande / antenn vuxna utan pupal skede. Odonata vuxna har en väl utvecklad färgseende och visar en anmärkningsvärd mångfald i kroppens färger och mönster över kön, stadier och arter. Medan många ekologiska och beteendemässiga studier på Odonata har genomförts, molekylär genetiska studier har varit knappa främst på grund av svårigheten att tillämpa genfunktionalanalys till Odonata. Till exempel är RNA-interferens (RNAi) mindre effektivt i Odonata, som rapporterats i Lepidoptera. För att övervinna detta problem, vi framgångsrikt etablerat en RNAi metod i kombination med in vivo elektroporation. Här ger vi ett detaljerat protokoll inklusive en video av den elektroporationsmedierade RNAi-metoden enligt följande: beredning av larver, artidentifiering, beredning av dsRNA/siRNA-lösning och injektionsnålar, iskall anestesi av larver, dsRNA/siRNA-insprutning, in vivo elektroporation och individuell uppfödning tills vuxen uppkomst. Den elektroporationsmedierade RNAi-metoden är tillämplig på både damselflies (underordning Zygoptera) och trollsländor (underordning Anisoptera). I detta protokoll presenterar vi metoderna för den blåstjärtade damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som ett exempel på damselfly arter och pied skimmer trollslända Pseudothemis zonata (Libellulidae) som ett annat exempel på trollslända arter. Som representativa exempel visar vi resultaten av RNAi inriktning melanin syntesen genen multicopper oxidas 2. Denna RNAi metod kommer att underlätta förståelsen av olika genfunktioner som deltar i metamorfos, morfogenes, färgmönster bildning, och andra biologiska funktioner i Odonata. Dessutom kan detta protokoll vara allmänt tillämpligt på icke-modellorganismer i vilka RNAi är mindre effektivt vid undertryckning av genen på grund av ineffektiviteten och den låga peneetriansen.
Trollsländor och damselflies (ordningen Odonata) är bland de mest förfädernas grupper av insekter som uppvisar “metamorfos”1,2. Genom metamorfos, de ändrar sin livsmiljö, morfologi, och beteende drastiskt från vattenlevande larver till markbundna / antenn vuxna3. Odonata vuxna har en väl utvecklad färgseende och representerar en anmärkningsvärd mångfald i kroppens färger och mönster över kön, stadier, och art3,4,5. Medan många ekologiska och beteendemässiga studier på Odonata har genomförts6,7, molekylär genetiska studier har hindrats främst av svårigheten att tillämpa genfunktionalanalys till Odonata.
Den konventionella RNA-interferensen (RNAi) metod, som dubblett-stranded RNA (dsRNA) injiceras i för att dämpa fungera av genen avintresserar 8, vänt ut för att vara ineffektiv i Odonatakryp 9, som anmält i Lepidopterankryp 10. Å andra sidan har tidigare rapporter föreslagit att electroporation-medierad RNAi är effektiv i Lepidopteran arter, särskilt i epidermal vävnader11,12,13. Vi fann nyligen att den elektroporation-medierad RNAi fungerar effektivt i den lilla trollslända Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea är en relativt sällsynt art och därför inte lämplig för molekylära genetiska studier.
De flesta Odonata arter klassificeras i endera av de två underordningar, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (sanna trollsländor)3. Här fokuserade vi på den blåstjärtade damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Bild 1A) som en representativ Zygopteran art och pied skimmer trollslända Pseudothemis zonata (Libellulidae; Bild 1B) som en representativ Anisopteran art. De två arterna är bland de vanligaste Odonata-arterna i naturliga och urbana dammar i Japan, inklusive de i Tsukuba City, och vi kan samla många larver av de två arterna i fältet. Nyligen etablerade vi ett laboratorium uppfödningssystem för enskilda larver av I. senegalensis, som möjliggjorde kontinuerlig övervakning av utveckling och morfogenes av Odonata larverna i detalj14.
I denna rapport, vi ger en förfinad metod och en video protokoll för den elektroporation-medierad RNAi i I. senegalensis och P. zonata. I Japan, I. senegalensis och Ischnura asiatica, som är genetiskt nära, ofta finns sympatrically15, och de är svåra att skilja ilarver 16. Vi beskriver också hur två Ischnura arter kan särskiljas genom begränsning fragment längd polymorfism (RFLP).
För att utvärdera effektiviteten av den elektroporation-medierad RNAi, väljer vi multicopper oxidas 2 gen (MCO2; även känd som laccase2) som en representativ målgen, på grund av den synliga fenotyp av blekare nagelband färg vid knockdown av genen uttrycket9. MCO2 är känt för att vara väsentlig för mörkning av epidermis i en mängd olika insektsarter17,18.
RNAi-behandlingens dödlighet
Vi fann att RNAi-behandlingens dödlighet beror starkt på Odonata-larvernas uppfödningshistorik och tillstånd. Larverna strax efter insamling på fältet är i allmänhet friska och uppvisar låg dödlighet efter den elektroporation-medierade RNAi behandling. Däremot tenderar de larver som föds upp i laboratoriet under en lång tid (t.ex. en månad) att lida låg framgång av vuxna uppkomst. I I. senegalensis, i stället för larverna som samlas i fält, kan larverna som föds upp i laboratoriet från ägg användas14, men framgångsfrekvensen för RNAi som använder de laboratorieuppfödda larverna tenderar att vara betydligt lägre (många individer dog under metamorfos) än de som använder de fältsamlade larverna. Dessutom är frekvent larvmatning och ren vattenuppfödning viktiga för att öka andelen framgångsrika vuxnas uppkomst och minska dödligheten hos RNAi-behandlingen.
Effektiviteten av RNAi behandling
Som beskrivits ovan uppvisade nivåerna av RNAi fenotyp, nämligen storlek och placering av nagelbanden avfärgning, ofta betydande variation mellan individer som utsätts för samma RNAi behandling (t.ex. Figur 4), men nivåerna av den fenotypiska peneetance verkar vara anmärkningsvärt olika mellan Odonata arter. De observerade fenotypiska regionerna var större och mer framträdande i I. senegalensis (Figurerna 4-5) än i P. zonata (Figur 6) och N. pygmaea9. Denna skillnad kan bero på tjockleken på nagelbanden på larvytan, med tanke på att nagelbanden av I. senegalensis är tunnare än nagelbanden hos P. zonata och N. pygmaea). Såvitt vi undersökte erkändes ingen tydlig skillnad mellan effekterna av siRNA och dsRNA (Figur 4, tabell 1).
Lämpligt utvecklingsstadium för RNAi
Det bör noteras att korrekt larviscensättning är viktigt för att utföra RNAi effektivt. Hämning av vuxna pigmentering orsakades av MCO2 RNAi före stadium D (cirka 3 dagar före vuxen uppkomst), vilket är förenligt med den tidigare rapporten om N. pygmaea9. De RNAi-fenotyper som observerades när de injicerades i stadierna C och D var mindre iögonfallande än de som behandlades i etapperna A och B, vilket tyder på att stadierna C och D kan vara för sent för att tillräckligt dämpa genuttrycket. Lämplig timing för RNAi behandling beror på tidpunkten för genuttryck, och MCO2 gen uppvisar övergående högt uttryck under vuxna uppkomst9, som i andra insekter17,18. I stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown av MCO2 genen observerades från dag 4 och framåt efter injektion27, vilket är förenligt med de nuvarande resultaten.
Vår tidigare studie om I. senegalensis visade att, efter etappen B, dagar till vuxen uppkomst uppvisar relativt liten variation bland majoriteten av slutliga instar larver, vilket tyder på att scenen B kan motsvara uppkomsten av processen mot vuxna uppkomst, varefter utvecklingsmässiga processer för metamorfos fortsätta i ett prefixed och samordnat sätt14. Morfologiska avvikelser orsakade av sår observerades ofta när larverna RNAi-behandlade vid stadierna C och D (Figur 7B, 7C). Detta är sannolikt att associeras med en dramatisk progression av metamorfos under dessa stadier, vilket tyder på att RNAi behandling bör undvikas från scenen C och på. Sammanfattningsvis rekommenderar vi att slutliga instar larver i stadium A eller B (eller på det stadium innan larvvingarna expanderar betydligt) bör användas för RNAi experiment.
Användbarhet och överlägsenhet av elektroporationsmedierad RNAi-metod
Den konventionella RNAi är en enkel och kraftfull experimentell metod, men vissa insekts härstamningar som fjärilar10, bladlöss28 och trollsländor9 uppvisar låg RNAi effektivitet, för vilka etablering av genfunktionsanalys är en stor utmaning. I denna studie fann vi att elektroporation-medierad RNAi kan inducera lokala gensupprbildning i trollsländor med nästan 100% effektivitet, åtminstone i epidermis, om de behandlas i lämpliga utvecklingsstadier (Tabell 1). Nyligen har CRISPR/Cas9-baserade gen knockouts framgångsrikt tillämpats på en mängd olika insekter, vilket ger ett kraftfullt molekylärgenetisk verktyg för icke-modellorganismer29. Här påpekar vi dock att CRISPR/Cas9 förvisso är bra men den elektroporationsmedierade RNAi-metoden kan vara överlägsen CRISPR/Cas9 i vissa avseenden.
För det första, i den elektroporationsmedierade RNAi-metoden kan kroppsregionen där RNAi-fenotyper uppträder enkelt kontrolleras experimentellt av den positiva elektrodens position vid elektroporation. Dessutom, eftersom regionen där genuttrycket undertrycks är begränsad runt den region där den positiva elektroden placerades, kan RNAi fenotyperna enkelt jämföras med kontroll fenotyperna sida vid sida i samma individ. För det andra, jämfört med CRISPR/Cas9-metoden där injicerade ägg måste födas upp till vuxen ålder för att observera knockout-fenotyperna, är den elektroporationsmedierade RNAi överlägsen på så sätt att genen knockdown-fenotyper vanligtvis kan observeras på mycket kortare tid. Till exempel tar det tre till fyra månader för I. senegalensis och ett till två år för P. zonata från ägg till vuxna14,30. För att observera RNAi fenotyper inom vuxenepdermis tar det dock mindre än en månad från dsRNA-injicering i slutinstarlar i stadium B till vuxenuppkomst för både I. senegalensis och P. zonata (Figur 7). För det tredje innebär den elektroporationsmedierade RNAi-metoden dsRNA-injektion i stora larver, vilket är lättare än mikroinjektion i små ägg som krävs för CRISPR/Cas9-metoden. Dessutom är den elektroporationsmedierade RNAi tillämplig på insektsarter vars nylagda ägg är svåra att samla in. Till exempel lägger honor av P. zonata ägg på flytande växter på vattenytan under flygning, och därmed är det svårt att samla sina ägg både på fältet och i labbet. Därav förväntar vi oss att detta protokoll kan vara allmänt tillämpligt på icke-modellorganismer där den konventionella RNAi-metoden inte fungerar effektivt.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Minoru Moriyama för teknisk rådgivning och stöder, Bin Hirota och Ryutaro Suzuki för att samla Odonata larver, och Misa Shinya för hjälpkommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 till GO och JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287, och JP20H04936 till RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |