使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备
Summary
此处描述了植物体内核苷酸/核苷酸定量的精确和可重复的方法。此方法采用 HPLC-MS/MS。
Abstract
核苷酸/核苷酸是核酸、糖体和酶、细胞信号分子和能量载体的构建基块，它们参与许多细胞活动。在这里，我们描述了一种快速可靠的方法，在植物核苷酸/核苷酸含量的绝对资格。简言之，用1mL的萃取缓冲液（甲醇、乙酮三酯和水的比例为2：2：1）提取了100毫克的均质植物材料。后来，样品被浓缩在冷冻干燥机中五次，然后注射到HPLC-MS/MS中。 核苷酸在多孔的石墨碳（PGC）柱上分离，核苷酸在C18柱上分离。每个核苷酸和核苷酸的质量转换都由质谱法监测。核苷酸和核苷酸的内容是根据其外部标准（ESTD）进行量化的。因此，使用这种方法，研究人员可以很容易地量化不同植物中的核苷酸/核苷酸。
Introduction
核苷酸/核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分，核酸和许多凝血素（如烟酰胺腺苷二聚氰胺）的前体，在磷脂、甘油脂和多糖等大分子的合成中非常重要。从结构上讲，核苷酸包含一个核碱基，它可以是腺苷、瓜宁、尿素、细胞氨酸或胸腺素，以及糖莫伊蒂，它可以是核糖或脱氧核糖酶1，2。核苷酸有多达三个磷酸盐组结合到核苷酸3的糖雾的5碳位置。植物中核苷酸的新陈代谢对种子发芽和叶生长至关重要。为了更好地了解它们在植物发育中的生理作用，应建立体内不同核苷酸/核苷酸的绝对定量方法。
测量核苷酸/核苷酸的最常用方法之一采用高性能液相色谱 （HPLC） 和紫外可见 （UV-VIS） 探测器 4、7、8、9、10、11。2013年，使用HPLC，达恩克和维特量化了几种类型的核苷酸在阿拉伯多普西萨利亚纳7。与野生类植物相比，他们在瓜诺辛脱氨酶基因的T-DNA插入突变体中发现了增强的瓜诺辛含量。另一种丙酰胺核苷，环丙胺，也定量检测在植物使用这种方法，这导致鉴定一个真正的赛迪丁脱氨酶基因4。然而，基于紫外线探测器，这种方法不能轻易区分具有相似光谱和保留时间的核苷，例如瓜诺辛或异种氨酸。HPLC方法的检测极限相对较高，因此，它常用于测量体内核苷含量高，如青氨酸、尿氨酸、瓜诺辛等。
此外，气相色谱与质谱学（GC-MS）相结合，也可用于核苷测量。受益于它，哈克等。在A.thaliana12的种子中成功检测出尿素和尿酸，这是核苷代谢通路的下游代谢物。然而，GC通常用于分离挥发性化合物，但不适合热阴唇物质。因此，液相色谱与质谱学（LC-MS/MS）相结合可能是一种更合适、更准确的分析技术，用于内在识别、分离和定量核苷酸/核苷酸13、14。先前的几项研究报告说，HILIC列可用于核苷酸和核苷酸分离15，16和同位素标记的内部标准被用于化合物定量17。但是，这两个组件都相对昂贵，尤其是商业同位素标记标准。在这里，我们报告一种经济适用的LC-MS/MS方法，用于核苷酸/核苷酸测量。这种方法已经成功地用于不同核苷酸/核苷酸的量定量，包括ATP，N6-甲基-AMP，AMP，GMP，尿丁，青氨酸，和伪尿素1，5，6，18，在植物和德罗索菲拉。此外，我们在这里报告的方法也可以用于其他生物体。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物体含有各种核苷酸/核苷酸，包括规范和异常核苷酸。然而，它们的起源和代谢端点，特别是经过修改的核苷酸，仍然模糊不清。此外，目前对核苷酸/核苷酸代谢功能和平衡的理解还有待探索和扩展。为了调查它们，需要采用精确和金标准的方法来识别和量化这些代谢物。在这里，我们描述了一个使用质量谱进行核苷酸/核苷酸检测的协议。以N1-甲基甲基诺辛为例，该方法可检测低至0….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中央大学基础研究基金（KJQN202060）、中国国家自然科学基金（31900907）、江苏省自然科学基金（BK20190528）、国际遗传工程和生物技术中心（CRP/CHN20-04_EC）和M.C的财政支持。 中央大学基础研究基金（LGZD202004）至X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
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