En præcis og reproducerbar metode til in vivo nukleotider/nukleotider kvantificering i planter er beskrevet her. Denne metode anvender en HPLC-MS/MS.
Nukleotider/nukleotider er byggesten af nukleinsyrer, dele af cosubstrater og coenzymer, cellesignaleringsmolekyler og energibærere, som er involveret i mange celleaktiviteter. Her beskriver vi en hurtig og pålidelig metode til absolut kvalificering af nukleoside/nukleotidindhold i planter. Kort sagt blev 100 mg homogeniseret plantemateriale udvundet med 1 ml ekstraktionsbuffer (methanol, acetonionstrid og vand i et forhold på 2:2:1). Senere blev prøven koncentreret fem gange i en frysetørrer og derefter injiceret i en HPLC-MS/MS. Nukleotider blev adskilt på en porøs grafitisk kulstof (PGC) kolonne og nukleotider blev adskilt på en C18 kolonne. Masseovergangene for hver nukleoside og nukleotid blev overvåget af massespektrometri. Indholdet af nukleotider og nukleotider blev kvantificeret i forhold til deres eksterne standarder (ESTD’er). Ved hjælp af denne metode kan forskere derfor nemt kvantificere nukleotider / nukleotider i forskellige planter.
Nukleotider/nukleotider er centrale metaboliske komponenter i alle levende organismer, som er forløbere for nukleinsyrer og mange coenzymer, såsom nicotinamid-adenin dinukleotid (NAD), og vigtige i syntesen af makromolekyler såsom fosfolipider, glykolipider og polysaccharider. Strukturelt indeholder nukleoside en nukleobase, som kan være en adenin, guanine, uracil, cytosin eller thymine og en sukkergeiety, som kan være en ribose eller en deoxyribose1,2. Nukleotider har op til tre fosfatgrupper, der binder sig til 5-carbon-positionen af nukleososidernes sukkermoiety3. Metabolismen af nukleotider i planter er afgørende for frøspiring og bladvækst4,5,6. For bedre at forstå deres fysiologiske roller i planteudviklingen bør metoderne til absolut kvantificering af forskellige nukleotider/nukleotider in vivo fastlægges.
En af de mest anvendte metoder til måling af nukleotider/nukleotider anvender en højtydende væskekromatografi (HPLC) kombineret med en ultraviolet-synlig (UV-VIS) detektor4,7,8,9,10,11. I 2013 kvantificerede ved hjælp af HPLC, Dahncke og Witte flere typer af nukleosiderne i Arabidopsis thaliana7. De identificerede et forbedret guanosinindhold i en T-DNA-indsættelsesmutant, der var målretning i guanosindeaminasegenet sammenlignet med den vilde type plante. En anden pyrimidinkerne, cytidin, blev også kvantitativt påvist i planter, der anvender denne metode, hvilket resulterede i identifikation af et bona fide cytidin deaminase gen4. Baseret på UV-detektoren kan denne metode imidlertid ikke let skelne mellem de nukleotider, der har lignende spektrum og retentionstider, f.eks. Påvisningsgrænsen for HPLC-metoden er relativt høj, derfor anvendes den ofte til måling af højt indhold af nukleotider in vivo, såsom cytidin, uridin og guanosin.
Desuden kan gaskromatografi kombineret med massespektrometri (GC-MS) også anvendes til nukleosidemåling. Nyder godt af det, Hauck et. al. med succes påvist uridin og urinsyre, som er en downstream metabolit af nukleoside kataboliske vej, i frøene af A. thaliana12. GC bruges dog normalt til at adskille flygtige forbindelser, men ikke egnet til de termiske labile stoffer. Derfor er en flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS/MS) sandsynligvis en mere egnet og nøjagtig analyseteknik til in vivo-identifikation, -adskillelse og -kvantificering af nukleotider/nukleotider13,14. Flere tidligere undersøgelser rapporterede , at der kan anvendes en HILIC-kolonne til nukleotider og nukleotiderseparation15,16 , og at der blev anvendt isotopisk mærkede interne standarder for den sammensatte kvantificering17. Begge komponenter er dog relativt dyre, især de kommercielle isotopmærkede standarder. Her rapporterer vi en økonomisk anvendelig LC-MS/MS-tilgang til nukleotider/nukleotider. Denne metode er allerede med succes blevet anvendt til kvantantitation af forskellige nukleotider / nukleotider, herunder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridin, cytidin og pseudouridin1,5,6,18, i planter og Droilasoph. Desuden kan den metode, vi rapporterer her, også anvendes i andre organismer.
Organismer indeholder forskellige nukleotider/nukleotider, herunder kanoniske og afvigende organismer. Imidlertid er oprindelsen og metaboliske endepunkter af dem, især modificerede nukleotider, stadig uklare. Desuden er den nuværende forståelse af funktionen og homøostase af nukleotider / nukleotider metabolisme stadig skal udforskes og udvides. For at undersøge dem skal der anvendes en præcis og guldstandardmetode til identifikation og kvantificering af disse metabolitter. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet økonomisk af grundforskningsfondene for de centrale universiteter (KJQN202060), National Natural Science Foundation of China (31900907), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20190528), International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) til M.C., og grundforskningsfondene for de centrale universiteter (LGZD202004) til X.L.
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |