Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS
Summary
Un método preciso y reproducible para la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas se describe aquí. Este método emplea una HPLC-MS/MS.
Abstract
Los nucleósidos/nucleótidos son bloques de construcción de ácidos nucleicos, partes de cosubstratos y coenzimas, moléculas de señalización celular y portadores de energía, que están involucrados en muchas actividades celulares. Aquí, describimos un método rápido y confiable para la calificación absoluta del contenido de nucleósidos / nucleótidos en plantas. Brevemente, se extrajeron 100 mg de material vegetal homogeneizado con 1 mL de tampón de extracción (metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1). Más tarde, la muestra se concentró cinco veces en un liofilizador y luego se inyectó en una HPLC-MS / MS. Los nucleótidos se separaron en una columna de carbono grafítico poroso (PGC) y los nucleósidos se separaron en una columna C18. Las transiciones de masa de cada nucleósido y nucleótido fueron monitoreadas por espectrometría de masas. El contenido de los nucleósidos y nucleótidos se cuantificó contra sus estándares externos (ESTDs). Usando este método, por lo tanto, los investigadores pueden cuantificar fácilmente nucleósidos/nucleótidos en diferentes plantas.
Introduction
Los nucleósidos/nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos, que son los precursores de los ácidos nucleicos y muchas coenzimas, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), e importantes en la síntesis de macromoléculas como fosfolípidos, glicolípidos y polisacáridos. Estructuralmente, el nucleósido contiene una nucleobase, que puede ser una adenina, guanina, uracilo, citosina o timina, y una mitad de azúcar, que puede ser una ribosa o una desoxirribosa1,2. Los nucleótidos tienen hasta tres grupos fosfato que se une a la posición de 5 carbonos de la mitad azucarada de los nucleósidos3. El metabolismo de los nucleótidos en las plantas es esencial para la germinación de las semillas y el crecimientode las hojas 4,5,6. Para comprender mejor sus funciones fisiológicas en el desarrollo de las plantas, deben establecerse los métodos para la cuantificación absoluta de diferentes nucleósidos/nucleótidos in vivo.
Uno de los enfoques más comúnmente utilizados para medir nucleósidos /nucleótidos emplea una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) junto con un detector ultravioleta-visible (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. En 2013, utilizando HPLC, Dahncke y Witte cuantificaron varios tipos de nucleósidos en Arabidopsis thaliana7. Identificaron un contenido mejorado de guanosina en un mutante de inserción de ADN T dirigido en el gen de la guanosina desaminasa en comparación con la planta de tipo salvaje. Otro nucleósido de pirimidina, la citidina, también se detectó cuantitativamente en plantas que empleaban este método, lo que resultó en la identificación de un gen de buena fe de la citidina desaminasa4. Basado en el detector UV, este método, sin embargo, no puede distinguir fácilmente los nucleósidos que tienen espectros y tiempos de retención similares, por ejemplo, guanosina o xantosina. El límite de detección del método de HPLC es relativamente alto, por lo tanto, se utiliza con frecuencia para la medición del alto contenido de nucleósidos in vivo, como citidina, uridina y guanosina.
Además, la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS) también se puede utilizar en la medición de nucleósidos. Beneficiándose de ella, Hauck et al. al. detectaron con éxito uridina y ácido úrico, que es un metabolito aguas abajo de la vía catabólica de nucleósidos, en las semillas de A. thaliana12. Sin embargo, gc se utiliza normalmente para separar compuestos volátiles, pero no es adecuado para las sustancias térmicamente lábiles. Por lo tanto, una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) es probablemente una técnica analítica más adecuada y precisa para la identificación in vivo, separación y cuantificación de los nucleósidos/nucleótidos13,14. Varios estudios previos informaron que una columna HILIC puede ser utilizada para la separación de nucleósidos y nucleótidos15,16 y se emplearon estándares internos marcados isotópicamente para la cuantificación de compuestos17. Sin embargo, ambos componentes son relativamente caros, especialmente los estándares comerciales etiquetados con isótopos. Aquí, se presenta un enfoque de LC-MS / MS económicamente aplicable para la medición de nucleósidos / nucleótidos. Este método ya se ha utilizado con éxito para la cuantificación de diversos nucleósidos / nucleótidos, incluyendo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina y pseudouridina1,5,6,18,en plantas y Drosophila. Por otra parte, el método que divulgamos aquí se puede utilizar en otros organismos también.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los organismos contienen varios nucleósidos/nucleótidos, incluyendo los canónicos y aberrantes. Sin embargo, el origen y los puntos finales metabólicos de ellos, especialmente nucleósidos modificados, son todavía obscuros. Además, la comprensión actual de la función y la homeostasis del metabolismo de nucleósidos/nucleótidos sigue siendo explorada y ampliada. Para investigarlos, es necesario emplear un método preciso y de referencia para la identificación y cuantificación de estos metabolitos. Aquí, se des…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (KJQN202060), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900907), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20190528), el Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (CRP/CHN20-04_EC) a M.C., y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (LGZD202004) a X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referências
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