Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.
O estresse oxidativo desempenha um papel crítico em várias doenças degenerativas, incluindo a degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma patologia que afeta ~30 milhões de pacientes em todo o mundo. Leva a uma diminuição no epitélio do pigmento da retina (RPE)-fatores neuroprotetores sintetizados, por exemplo, fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e fator estimulante da colônia granutócito-macrófago (GM-CSF), seguido pela perda de células RPE, e eventualmente fotorreceptor e morte de células gânglios de retina (RGC). Temos a hipótese de que a reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE transfecidas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular. Usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB100X)as células RPE humanas foram transfectadas com os genes PEDF e GM-CSF e mostraram integração genética estável, expressão genética de longo prazo e secreção de proteínas usando qPCR, mancha ocidental, ELISA e imunofluorescência. Para confirmar a funcionalidade e a potência do PEDF e gm-CSF secretados pelas células RPE transfeinadas, desenvolvemos um ensaio in vitro para quantificar a redução do estresse oxidativo induzido por H2O2em células RPE na cultura. A proteção celular foi avaliada pela análise da morfologia celular, densidade, nível intracelular de glutationa, expressão genética UCP2 e viabilidade celular. Ambas as células RPE transfectadas que expressam o FPE e/ou GM-CSF e as células não transfetizadas, mas pré-tratadas com PEDF e/ou GM-CSF (comercialmente disponíveis ou purificadas de células transfetizadas) apresentaram proteção celular antioxidante significativa em comparação com controles não tratados. O atual modelo H2O2é uma abordagem simples e eficaz para avaliar o efeito antioxidante de fatores que podem ser eficazes para tratar a AMD ou doenças neurodegenerativas similares.
O modelo descrito aqui, oferece uma abordagem útil para avaliar a eficiência dos agentes biofarmacêuticos para reduzir o estresse oxidativo nas células. Utilizamos o modelo para investigar os efeitos protetores do PEDF e do GM-CSF no estresse oxidativo mediado H2O2nas células epiteliais do pigmento retinal, que estão expostas a altos níveis de O2, luz visível, e a fagocitose das membranas do segmento externo fotoreceptor, gerando níveis significativos de espécies reativas de oxigênio (ROS)1, 2. São considerados um dos principais contribuintes para a patogênese da degeneração macular avascular relacionada à idade (aAMD)3,4,5,6,7,8. Além disso, há uma diminuição nos fatores neuroprotetores sintetizados por RPE, especificamente o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) e fator estimulante da colônia-colônia granucyte (GM-CSF) levando à disfunção e perda de células RPE, seguidos pela morte de células fotorreceptoras e gânglios da retina (RGC)3,4,5 . A AMD é uma doença complexa que resulta da interação entre fatores metabólicos, funcionais, genéticos e ambientais4. A falta de tratamentos para a AAMD é a principal causa de cegueira em pacientes com mais de 60 anos de idade em países industrializados9,10. A reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE geneticamente modificadas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular11,12,13,14,15,16 . Embora existam várias metodologias para entregar genes às células, escolhemos o sistema transposon da Bela Adormecida hiperativo não viral para entregar os genes PEDF e GM-CSF às células RPE por causa de seu perfil de segurança, a integração dos genes no genoma das células hospedeiras e sua propensão a integrar os genes entregues em locais não transcricionalmente, como mostramos anteriormente17, 18,19.
O estresse oxidativo celular pode ser induzido em células cultivadas in vitro por vários agentes oxidativos, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),4-hidroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), altas tensões de oxigênio e luz visível (espectro completo ou irradiação UV)20,21. Altas tensões de oxigênio e luz requerem equipamentos e condições especiais, o que limita a transferência para outros sistemas. Agentes como H2O2,HNE e tBH induzem alterações moleculares e celulares por estresse oxidativo. Escolhemos H2O2 para testar a atividade antioxidante do PEDF e GM-CSF porque é conveniente e biologicamente relevante, pois é produzido por células RPE como um intermediário de oxigênio reativo durante a fagocitose do segmento externo fotoreceptor22 e é encontrado em tecidos oculares in vivo23. Como a oxidação da glutationa pode ser parcialmente responsável pela produção de H2O2 no olho, analisamos os níveis de GSH/glutationa em nossos estudos, que estão ligados ao estresse oxidativo induzido por H2O2e à capacidade regenerativa das células21,22. A análise dos níveis de glutationa é especialmente relevante, pois participa dos mecanismos de proteção antioxidantes no olho24. A exposição a H2O2 é utilizada com frequência como modelo para examinar a suscetibilidade ao estresse oxidativo e a atividade antioxidante das células RPE1,25,26,27,28,29,30, e, além disso, apresenta semelhanças com danos oxidativos induzidos pela luz, fonte “fisiológica” de estresse oxidativo21.
Para avaliar a funcionalidade e a eficácia dos fatores neuroprotetores, desenvolvemos um modelo in vitro que permite que a análise quantifique o efeito antioxidante dos fatores de crescimento expressos por células geneticamente modificadas para superexpressar o PEDF e o GM-CSF. Aqui, mostramos que as células RPE transfeminadas com os genes para PEDF e GM-CSF são mais resistentes aos efeitos nocivos de H2O2 do que são células de controle não transfectadas, como evidenciado pela morfologia celular, densidade, viabilidade, nível intracelular de glutationa e expressão do gene UCP2, que codifica a proteína mitocondrial de desacoplamento 2 que tem sido demonstrada para reduzir espécies reativas de oxigênio (ROS)31.
O protocolo aqui apresentado oferece uma abordagem para analisar a função antioxidante e protetora do PEDF e GM-CSF produzido por células transfeinadas, que podem ser aplicadas a células transfeinadas com qualquer gene benéfico putativo. Em estratégias terapêuticas genéticas que têm o objetivo de fornecer proteínas ao tecido por meio do transplante de células geneticamente modificadas, é fundamental obter informações quanto ao nível de expressão proteica, à longevidade da expressão e à eficácia da pro…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Gregg Sealy e Alain Conti pela excelente assistência técnica e prof. Zsuzsanna Izsvák do Centro Max-Delbrück em Berlim por fornecer gentilmente os plasmídeos pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências suíça e pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro. Z.I foi financiado pelo European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].
24-well plates | Corning | 353047 | |
6-well plates | Greiner | 7657160 | |
96-well culture plate white with clear flat bottom | Costar | 3610 | Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay) |
96-well plates | Corning | 353072 | |
Acrylamid 40% | Biorad | 161-0144 | |
Amphotericin B | AMIMED | 4-05F00-H | |
Antibody anti-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
Antibody anti-PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
Antibody anti-penta-His | Qiagen | 34660 | |
Antibody anti-phospho-Akt | Cell Signaling Technology | 9271 | |
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
ARPE-19 cell line | ATCC | CRL-2302 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
chamber culture glass slides | Corning | 354118 | |
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
Duo Set ELISA kit | R&D Systems | DY215-05 | |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
GraphPad Prism software (version 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
hydrogen peroxide (H2O2) | Merck | 107209 | |
ImageJ software (image processing program) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014 | ||
Imidazol | Axonlab | A1378.0010 | |
Leica DMI4000B microscope | Leica Microsystems | ||
LightCycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | ||
LightCycler 480 SW1.5.1 software | Roche Molecular Systems | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
Nitrocellulose | VWR | 732-3197 | |
Omega Lum G Gel Imaging System | Aplegen Life Science | ||
PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
Primers | Invitrogen | See Table 1 in Supplementary Materials | |
pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak | ||
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
recombinant hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
recombinant hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System | Promega | Z6011 | |
RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
RNase-free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
SDS | Applichem | A2572 | |
Semi-dry transfer system for WB | Bio-Rad | ||
SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
Tris-buffered saline (TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Tween | AppliChem | A1390 | |
Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
WesternBright ECL HRP substrate | Advansta | K-12045-D50 | |
Whatman nitrocellulose membrane | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |