Denne protokollen tar sikte på å fremstille 3D hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing celler i hengende dråper. Kollagen-innebygde CSs behandles med doksorubicin (DOX, et kardiotoksisk middel) ved fysiologiske konsentrasjoner for å modellere hjertesvikt. In vitro-testing med DOX-behandlede CS-er kan brukes til å identifisere nye behandlinger for hjertesviktpasienter.
Til tross for flere fremskritt innen hjertevevsteknikk, er en av de store utfordringene for å overvinne fortsatt generasjonen av et fullt funksjonelt vaskulært nettverk bestående av flere nivåer av kompleksitet for å gi oksygen og næringsstoffer innen bioingeniørhjertevev. Vårt laboratorium har utviklet en tredimensjonal in vitro modell av det menneskelige hjerte, kjent som “hjertesfæroid” eller “CS”. Dette presenterer biokjemiske, fysiologiske og farmakologiske egenskaper som er typiske for det menneskelige hjerte og genereres ved å co-culturing sine tre store celletyper, som hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Humane induserte pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs) er co-kultivert i forhold som tilnærmer de som finnes in vivo med menneskelige hjertefibroblaster (HCFer) og humane koronararterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturplater i tre til fire dager. Den confocal analyse av CSs farget med antistoffer mot hjerte Troponin T, CD31 og vimentin (markører for hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis) viser at CSs presentere en kompleks endotelcellenettverk, som ligner den innfødte som finnes i det menneskelige hjerte. Dette bekreftes av 3D-gjengivelsesanalysen av disse konfokale bildene. CSs også presentere ekstracellulære matrise (ECM) proteiner typisk for det menneskelige hjerte, som kollagen type IV, laminin og fibronectin. Til slutt presenterer CSs en kontraktil aktivitet målt som syncytial kontraktilitet nærmere den som er typisk for det menneskelige hjertet sammenlignet med CSs som bare inneholder iCMer. Når det behandles med et kardiotoksisk antikreftmiddel, som doksorubicin (DOX, brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), reduseres levedyktigheten til DOX-behandlede CS-er betydelig ved 10 μM genetisk og kjemisk hemming av endotelial nitrogenoksidsyntase, et nedstrømsmål for DOX i HCFs og HCAECer, redusert toksisitet i CSs. Gitt disse unike funksjonene, CSs er for tiden brukt som in vitro modeller for å studere hjerte biokjemi, patofysiologi, og farmakologi.
Det menneskelige hjerte har en begrenset regenerativ kapasitet mens kardiovaskulær sykdom (CVD) fortsatt er den viktigste dødsårsaken over hele verden til tross for de siste fremskrittene innen vevsteknikk og stamcelleteknologi1. Behovet for nye terapeutiske midler, inkludert molekylære og cellulære tilnærminger for å enten reparere et skadet hjerte eller for å forhindre at et hjerte svikter, er et av de viktigste nåværende kliniske behovene for pasienter som lider avhjertesykdom 2,3,4. Hovedmålet med hjertevev engineering er å fremstille en tredimensjonal (3D) hjertevev som presenterer molekylære, cellulære, og ekstracellulære funksjoner typisk for et menneskehjerte, inkludert det vaskulære nettverket og fysiologisk kontraktil funksjon4,5,6.
For å bioingeniør og fremstille et funksjonelt menneskelig hjertevev som etterligner det menneskelige hjerte for in vitro og in vivo-applikasjoner, har flere tilnærminger blitt undersøkt, inkludert konstruert hjertevev (EHTs), celleark og sfæroidkulturer7,8. Imidlertid, disse vevene mislykkes i å rekapulere den optimale 3D mikromiljø typisk for det menneskelige hjerte og deres potensielle bruk for CVD pasienter kan ikke direkte oversette fra benken til sengen7. Dette er fordi de ikke rekafulerer den komplekse biologien, morfologien og fysiologien til in vivo hjertevev9. En av de store utfordringene i hjertevevsteknikk inkluderer utviklingen av et hierarkisk vaskulært nettverk i det bioengineerte hjertevevet, da ethvert vev som er større enn 200 μm i diameter utvikler celledød i midten2,10. Et riktig dannet vaskulært nettverk i et menneskelig hjertevev spiller en viktig rolle for tilførsel av blod, oksygen og næringsstoffer til hjerteceller11. Under embryonisk utvikling dannes koronarkapillærer og arterier via vaskogenese (de novo blodkardannelse) og angiogenese (generering av blodkar fra eksisterende) fra endotelstamceller8,12. Hjertefibroblaster spiller også en viktig rolle i riktig vaskulær nettverksdannelse ved å gi den optimale ekstracellulære matrisen (ECM) og vekstsammensetning13,14.
3D vaskulært nettverk av bioingeniør hjertevev kontrollerer celleoverlevelse og funksjon ved å skape oksygen og næringsgradienter og paracrine signalering, som homotypisk celle interaksjon, heterotypisk celle interaksjon, interaksjon av celler gjennom utskilles løselige proteiner og celle til ECMinteraksjoner 3,10,15,16,17,18. Dette forhindrer celledød i midten av vevet og fremmer celle levedyktighet og fysiologisk funksjon i bioingeniør hjertevev16,18,19.
Sfæroidkulturer fra stamceller har nylig blitt utforsket som in vitro modeller av det menneskelige hjerte20. For ytterligere å forbedre hjertemikromiljøet in vitro, har de inkludert bruk av alle de viktigste celletypene som finnes i det menneskelige hjerte, som hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster. Sfæroidkulturer presenterer den nødvendige 3D strukturelle støtten for celler for å vokse og fungere og kan brukes til å bioingeniør et vaskulærtnettverk 14,20,21,22. I denne sammenheng har vårt laboratorium utviklet menneskelige hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster i forhold som finnes i det menneskelige hjerte14. Denne modellen er en utvidelse av rotte ventrikulære hjerteceller sfæroid modell, generert av co-culturing hjerteceller i hengende dråpe kulturer, brukes til å modellere hjertefibrose21. Human CSs kan brukes som toksisitetsanalyser ved å behandle dem doksorubicin (DOX, et anti-kreftmiddel som brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), som er kjent for å indusere hjertefibrose og hjertesvikt (HF) selv 17 år etter sin somministrasjon14.
I dette manuskriptet beskriver vi hvordan vi genererer menneskelige CS-er ved å co-culturing human indusert pluripotente stamcelle avledet kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs), menneskelige hjertefibroblaster (HCFs) og menneskelige koronar arterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturer. For å bruke og bilde CSs for in vitro testing, er de innebygd i en kollagengel. Den konfokale analysen av CS-er farget med antistoffer mot CD31, en markør for endotelceller, viste at disse cellene danner et nettverk som ligner på det som ble observert in vivo. For å indusere HF og potensielt teste nye midler som kan behandle eller forhindre det, ble CSs behandlet med 10 μM DOX (en konsentrasjon funnet i blodet av kreftpasienter som fikk stoffet). Når farget med calcein-AM og ethidium homodimer (farging levende og døde celler, henholdsvis), DOX-behandlet CSs presentere en betydelig reduksjon i levedyktighet i forhold til CSs som ikke fikk stoffet. CSs presenterer også en homogen kontraktil aktivitet når tempoet ved hjelp av feltet potensiellstimulering mellom 1 og 3 Hz.
Utviklingsmessig er riktig vaskulær nettverksdannelse avgjørende for generering av funksjonelle vev, inkludert det menneskelige hjerte10,12,23,24,25,26. Vurdering for riktig vaskularisering av 3D-vev tillater utveksling av oksygen, vekstfaktorer, signalmolekyler og næringsstoffer, og forhindrer utvikling av cellenekrose i noe vev tykkere enn 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Foreløpig tilgjengelig in vitro 3D hjertemodeller som presenterer et vaskulært nettverk er primært presentere kapillær-størrelse, uorganisert vaskulære nettverk og mangler hierarkisk kompleks forgrenet vaskularisering observert in vivo6,8,29. Den alternative tilnærmingen til å utvikle komplekse hjerte endotelcellenettverk beskrevet i dette manuskriptet presenterer forbedret celle levedyktighet og funksjon sammenlignet med eksisterende modeller (Figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellerer det menneskelige hjertet ved bedre å rekapulere in vivo mikromiljøet, inkludert molekylære, cellulære og ekstracellulærekomponenter 14,22. CS generasjon fra stamcelle-avledede celler i hengende dråper tillate sine kulturer i definerte forhold (f.eks celletyper og forhold, riktig vevdannelse). Co-kulturer av iCMs sammen med HCFs og HCAECs i CS definere molekylær og cellulær crosstalk som regulerer hjertet patofysiologi, inkludert sin kontraktile funksjon og respons på legemidler ved konsentrasjoner som finnes i pasientens blodbanen14. På grunn av disse unike funksjonene har CS-er blitt brukt til å modellere hjertefibrose, en alvorlig konsekvens av hjerteinfarkt og hjertesvikt21. Våre tidligere studier viste hvordan tilstedeværelsen av både endotelceller og fibroblaster er avgjørende for rekapbilisering av vaskulær mikromiljø i det menneskelige hjerte, slik at optimal avsetning av fibroblast-avledede ECM-proteiner, som laminin, fibronectin og kollagen type IV, lokalisert i nærheten av et utviklende endotelcellenettverk14,21.
DOX er et velkjent kardiotoksisk legemiddel som kan utvikle hjertesvikt hos kreftpasienter selv 17 år etter behandlingen30. Likevel er det fortsatt et stoff av valget for behandling av leukemi og lymfom hos pediatriske pasienter og brystkreft hos kvinner30. DOX-behandling i CSs har da blitt brukt til å modellere hjertesvikt (HF) in vitro for å studere både mekanismene som regulerer toksisitet i hjertemocytter, endotelceller og fibroblaster14 og modell HF-indusert hjertefibrose21. Celleleveabiliteten ble statistisk redusert i DOX-behandlede CS-er innen 24 timer når de ble eksponert for stoffet ved konsentrasjonen som ble funnet i blodet av kreftpasienter (mellom 5 og 10 μM)14 (figur 2). Tidligere studier i laboratoriet vårt viste også de toksiske effektene av DOX på både hjerteendeotelceller og fibroblaster via endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS) ved hjelp av både genetiske og kjemiske hemmere av denne signalveien14. Bruk av genetisk (NOS3 shRNA) og kjemiske (N5-(1-iminoethyl)-L-ornitin, dihydroklorid, eller L-NIO) antagonister av eNOS signalveien som et nedstrøms mål for DOX forhindret sine toksiske effekter i både hjerte endotelceller og fibroblaster14.
Kontraktil aktivitet innen CSs har også blitt målt takket være elektrisk kobling av hjerteceller når de utsettes for feltpotensial stimulering. Vi fant at CSs kultivert med kontrollmedier (DOX 0 μM) kontrakt spontant og homogent med en slaghastighet som kan paced av feltstimulering innen 1 og 3 Hz, sammenlignbar med et sunt menneskehjerte. Dox-behandlede CS-er følger derimot ikke den elektriske stimuleringen, da de ikke kan trekke seg sammen. Sammen med målinger av celle levedyktighet og toksisitet ved hjelp av calcein-AM og ethidium homodimer, denne funksjonelle analysen for CS kontraktil funksjon tillate evaluering av det komplekse scenariet typisk for det menneskelige hjerte in vitro, for tiden ikke oppnåelig med andre modeller. Sammenlignet med kontraktile aktivitetsmålinger av enkelthjerteceller som bruker samme system, er vi ikke i stand til å visualisere og måle sarkomene i CSs. Derfor er vi begrenset til målinger av % sfæroid forkortelse over tid, en analyse vi måtte utvikle i laboratoriet vårt. Når vi kontrollerer antall celler, vi co-kultur i hver CS og derfor størrelsen på hver CS, bruker vi CSs med lignende størrelse som faktisk presenterer homogen kontraktil funksjon. Men selv i tilfelle vi genererte CS-er av forskjellige størrelser, endret ikke deres kontraktile aktivitet.
Det er også viktig å rapportere at CSs flercellede natur gjør dem tunge nok til å lokalisere nederst på dekkslippen i Ion-Optix-systemet, selv i tilfelle de er superfundert. Basert på det faktum at CSs sitter alene i en bestemt posisjon, trenger vi ikke å få dem til å følge dekkslippen, tvert imot hva som vanligvis gjøres med enkelthjerteceller i de fleste laboratorier.
Den mikroskopiske analysen av CS-er farget med antistoffer mot hjertetroponin T, CD31/PECAM og PECAM (som markører for iCMer, HCAECer og HCFer) viste dannelsen av et endotelcellenettverk (figur 1, blå). For å utelukke nekrose fullt ut i den indre delen av CSs, ble romlig evaluering av celle levedyktighet utført i vårt laboratorium ved konfokal analyse av calcein-AM / ethidium homodimer farget CS(data ikke vist). Det er imidlertid viktig å erkjenne at fremtidig utvikling i biofabrikasjonsfeltet for bedre å rekafulere andre komplekse funksjoner som er typiske for det menneskelige hjertet in vivo, for tiden ikke tilgjengelig i den eksisterende modellen. Disse inkluderer: i) kontraktil funksjon typisk for voksne kardiomyocytter; ii) blodstrøm og trykkkrefter; iii) paracrine signalering; iv) immunrespons, som vil være avgjørende for å forbedre dette og andre in vitro hjertemodeller6. Som enhver annen modell tar sikte på å rekastatere viktige funksjoner i enten et sunt vev eller en sykdomstilstand, protokollen for generering og bruk av CS beskrevet i dette manuskriptet tar sikte på å hjelpe forskeren på å løse spesifikke spørsmål, som kanskje ikke er uttømmende ved hjelp av denne tilnærmingen. For eksempel, den potensielle bruken av pasient-avledede celler for generering av CSs ville gi verktøy for personlig medisin, for tiden ikke tilgjengelig ved hjelp av allment tilgjengelige høy gjennomstrømning analyser for kardiovaskulær forskning.
Til slutt viste vi en enkel måte å bedre rekabrere det menneskelige hjertemikromiljøet ved hjelp av hjerteceller. Hjertesfæroider presenterer et endotelcellenettverk som bedre rekafulerer den som er tilstede i det menneskelige hjerte sammenlignet med monolayerkulturer i hjerteceller. Gitt deres unike egenskaper, representerer de avanserte verktøy for in vitro testing for kardiovaskulær forskning. Fremtidige studier ved hjelp av pasientavledede celler kan gi alternativer for personlig medisin og nye terapier for både å forebygge og bedre behandle kardiovaskulær sykdom.
The authors have nothing to disclose.
En spesiell takk til Nat Johnston for innspillingen og redigering av videoen.
Poonam Sharma ble støttet av University of Newcastle med UNIPRS og UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipender. Carmine Gentile ble støttet av en UTS Seed Funding, katolsk erkebispedømme av Sydney Grant for Adult Stem Cell Research og en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |