Detta protokoll syftar till att fabricera 3D hjärt sfäroider (CSs) genom co-culturing celler i hängande droppar. Kollagen-inbäddade CSs behandlas med doxorubicin (DOX, ett kardiotoxiskt medel) vid fysiologiska koncentrationer för att modellera hjärtsvikt. In vitro-testning med DOX-behandlade CSs kan användas för att identifiera nya terapier för hjärtsviktspatienter.
Trots flera framsteg inom hjärtvävnadsteknik, är en av de största utmaningarna att övervinna fortfarande genereringen av ett fullt fungerande kärlnätverk bestående av flera nivåer av komplexitet för att ge syre och näringsämnen inom bioengineered hjärtvävnader. Vårt laboratorium har utvecklat en tredimensionell in vitro-modell av det mänskliga hjärtat, känd som “hjärt sfäroid” eller “CS”. Detta presenterar biokemiska, fysiologiska och farmakologiska funktioner som är typiska för det mänskliga hjärtat och genereras genom co-culturing dess tre stora celltyper, såsom hjärt myocyter, endotelceller och fibroblaster. Mänskliga inducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs eller ICMs) är co-odlade vid nyckeltal approximera de som finns i vivo med mänskliga hjärt fibroblaster (HCFs) och mänskliga födans gatan endotelceller (HCAECs) i hängande droppe kultur plattor för tre till fyra dagar. Den confocal analys av CSs färgas med antikroppar mot hjärt Troponin T, CD31 och vimentin (markörer för hjärt myocyter, endoteliala celler och fibroblaster, respektive) visar att CSs presentera en komplex endotel cell nätverk, som liknar den infödda som finns i det mänskliga hjärtat. Detta bekräftas av 3D-renderingsanalysen av dessa konfokala bilder. CSs också presentera extracellulära matris (ECM) proteiner som är typiska för det mänskliga hjärtat, såsom kollagen typ IV, laminin och fibronectin. Slutligen, CSs presentera en kontraktil verksamhet mätt som syncytial kontraktilitet närmare den som är typisk för det mänskliga hjärtat jämfört med CSs som innehåller ICMs bara. När behandlas med en kardiotoxisk anti-cancer agent, såsom doxorubicin (DOX, används för att behandla leukemi, lymfom och bröstcancer), livskraften hos DOX-behandlade CSs minskas avsevärt vid 10 μM genetiska och kemiska hämning av endothelial kväveoxid syntas, en nedströms mål för DOX i HCFs och HCAECs, minskade dess toxicitet i CSS. Med tanke på dessa unika egenskaper, CSs används för närvarande som in vitro-modeller för att studera hjärtat biokemi, patofysiologi, och farmakologi.
Det mänskliga hjärtat har en begränsad regenerativ kapacitet medan hjärt-kärlsjukdom (CVD) fortfarande är den främsta dödsorsaken i hela världen trots de senaste framstegen inom vävnadsteknik och stamcellsteknik1. Behovet av nya therapeutics inklusive molekylära och cellulära metoder för att antingen reparera ett skadat hjärta eller för att förhindra ett hjärta från att misslyckas är en av de stora nuvarande kliniska behoven för patienter som lider av hjärtsjukdom2,3,4. Det huvudsakliga målet med hjärtvävnadsteknik är att fabricera en tredimensionell (3D) hjärtvävnad som presenterar molekylära, cellulära och extracellulära funktioner som är typiska för ett mänskligt hjärta, inklusive dess vaskulära nätverk och fysiologiska kontraktilafunktion 4,5,6.
För att bioengineer och fabricera en funktionell mänsklig hjärtvävnad som efterliknar det mänskliga hjärtat för in vitro- och in vivo-tillämpningar har flera tillvägagångssätt undersökts inklusive konstruerade hjärtvävnader (EHT), cellark och sfäroidkulturer7,8. Dessa vävnader misslyckas dock med att rekapitulera den optimala 3D-mikromiljö som är typisk för det mänskliga hjärtat och deras potentiella användning för CVD-patienter kan inte direkt översätta från bänken till sängkanten7. Detta beror på att de inte rekapitulera den komplexa biologi, morfologi, och fysiologi in vivohjärtvävnader 9. En av de stora utmaningarna inom hjärtvävnadsteknik innefattar utvecklingen av ett hierarkiskt kärlnätverk inom den biotekniska hjärtvävnaden, eftersom all vävnad som är större än 200 μm i diameter utvecklar celldöd i mitten2,10. En korrekt bildade vaskulära nätverk i en mänsklig hjärtvävnad spelar en stor roll för tillförsel av blod, syre och näringsämnen till hjärtceller11. Under embryonal utveckling bildas koronar kapillärer och artärer via vasculogenesis (de novo blodkärlsbildning) och angiogenes (generering av blodkärl från redan existerande) från endotel progenitorceller8,12. Hjärtfibroblast spelar också en stor roll i korrekt vaskulär nätverksbildning genom att tillhandahålla den optimala extracellulära matrisen (ECM) ochtillväxtsammansättning 13,14.
3D-vaskulär nätverk av bioengineered hjärtvävnader styr cellernas överlevnad och funktion genom att skapa syre och näringsämnen gradienter och paracrin signalering, såsom homotypisk cell interaktion, heterotypisk cell interaktion, interaktion av celler genom utsöndras lösliga proteiner och cell till ECM interaktioner3,10,15,16,17,18. Detta förhindrar celldöd i mitten av vävnaden och främjar cellernas livskraft och fysiologiska funktion i bioengineered hjärtvävnader16,18,19.
Sfäroidkulturer från stamceller har nyligen utforskats som in vitro-modeller av det mänskliga hjärtat20. För att ytterligare förbättra hjärtmikromiljö in vitro, de har inkluderat användningen av alla de viktigaste celltyper som finns i det mänskliga hjärtat, såsom hjärt myocyter, endotelceller, och fibroblaster. Sfäroidkulturer presenterar det nödvändiga 3D-strukturstödet för att celler ska växa och fungera och kan användas för att bioengineer ettkärlnätverk 14,20,21,22. I detta sammanhang har vårt laboratorium utvecklat mänskliga hjärt sfäroider (CSs) genom co-culturing hjärt myocyter, endotelceller och fibroblaster vid nyckeltal som finns i det mänskliga hjärtat14. Denna modell är en expansion av råttan ventrikulära hjärtceller sfäroid modell, som genereras av co-culturing hjärtceller i hängande droppe kulturer, som används för att modellera hjärt fibros21. Mänskliga CSs kan användas som toxicitet assays genom att behandla dem doxorubicin (DOX, en anti-cancer agent som används för att behandla leukemi, lymfom och bröstcancer), som är välkänt för att framkalla hjärtfibros och hjärtsvikt (HF) även 17 år efter dess somministration14.
I detta manuskript beskriver vi hur man genererar mänskliga CSs genom co-culturing mänskliga inducerad pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs eller ICMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCFs) och mänskliga födans gatan endotelceller (HCAECs) i hängande droppe kulturer. För att kunna använda och avbilda CSs för in vitro-testning är de inbäddade i en kollagengel. Konfokal analys av CSs färgas med antikroppar mot CD31, en markör för endotelceller, visade att dessa celler bildar ett nätverk som liknar den som observerats in vivo. För att inducera HF och potentiellt testa nya medel som kan behandla eller förhindra det, behandlades CSs med 10 μM DOX (en koncentration som finns i blodomloppet hos cancerpatienter som fick läkemedlet). När färgas med calcein-AM och ethidium homodimer (färgning levande och döda celler, respektive), DOX-behandlade CSs presentera en betydande minskning av lönsamheten i jämförelse med CSs som inte fick drogen. CSs också presentera en homogen kontraktil verksamhet när paced med hjälp av fältet potential stimulering mellan 1 och 3 Hz.
Utvecklingsmässigt är korrekt kärlnätverksbildning avgörande för generering av funktionella vävnader, inklusive det mänskliga hjärtat10,12,23,24,25,26. Hänsyn till korrekt vaskulärisering av 3D vävnader möjliggör utbyte av syre, tillväxtfaktorer, signalmolekyler och näringsämnen, förhindra utvecklingen av cellnekros inom någon vävnad tjockare än 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. För närvarande finns in vitro 3D-hjärta modeller som presenterar ett vaskulär nätverk är främst presentera kapillär-storlek, oorganiserade vaskulära nätverk och saknar den hierarkiska komplexa grenade vascularization observerats in vivo6,8,29. Det alternativa tillvägagångssättet för att utveckla komplexa hjärt endotelescellnätverk som beskrivs i detta manuskript presenterar förbättrad cell livskraft och funktion jämfört med befintliga modeller (figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellera det mänskliga hjärtat genom att bättre rekapitulera dess in vivo mikromiljö, inklusive dess molekylära, cellulära och extracellulärakomponenter 14,22. CS-generering från stamceller-härledda celler i de hängande dropparna tillåter sina kulturer i definierade förhållanden (t.ex., celltyper och förhållande, korrekt vävnadsbildning). Co-kulturer av iCMs tillsammans med HCFs och HCAECs inom CSs definierar den molekylära och cellulära överhörning som reglerar hjärtat patofysiologi, inklusive dess kontraktila funktion och svar på läkemedel vid koncentrationer som finns i patientens blodomloppet14. På grund av dessa unika egenskaper, CSs har utnyttjats för att modellera hjärt fibros, en allvarlig följd av hjärtinfarkt och hjärtsvikt21. Våra tidigare studier visade hur närvaron av både endotelceller och fibroblaster är avgörande för rekapitulation av den vaskulära mikromiljö i det mänskliga hjärtat, vilket möjliggör en optimal deposition av fibroblast-härledda ECM-proteiner, såsom laminin, fibronectin och kollagen typ IV, lokaliserad i närheten av ett utvecklande endotelcellsnätverk14,21.
DOX är ett välkänt kardioxiskt läkemedel som kan utveckla hjärtsvikt hos cancerpatienter även 17 år efter deras behandling30. Ändå, Det är fortfarande ett läkemedel val för behandling av leukemi och lymfom hos pediatriska patienter och bröstcancer hos kvinnor30. DOX behandling i CSs har sedan använts för att modellera hjärtsvikt (HF) in vitro för att studera både de mekanismer som reglerar toxiciteten i hjärtmyocyter, endotelceller och fibroblaster14 och för att modellera HF-inducerad hjärtfibros21. Cellens viabilitet minskade statistiskt i DOX behandlade CSs inom 24 h när den exponerades för läkemedlet vid den koncentration som finns i blodomloppet hos cancerpatienter (mellan 5 och 10 μM)14 (Figur 2). Tidigare studier i vårt laboratorium visade också toxiska effekter av DOX på både hjärt endotelceller och fibroblaster via endotel kväveoxid syntas (eNOS) med hjälp av både genetiska och kemiska hämmare av denna signalering väg14. Användning av genetiska (NOS3 shRNA) och kemiska (N5-(1-iminoetyl)-L-ornitin, dikklorid, eller L-) antagonister av eNOS signalväg som ett nedströms mål för DOX förhindrade dess toxiska effekter i både hjärt endothelial celler och fibroblaster14.
Kontraktil aktivitet inom CSs har också mätts tack vare den elektriska kopplingen av hjärtceller när de utsätts för fältpotentialstimulering. Vi fann att CSs odlade med kontroll media (DOX 0 μM) kontrakt spontant och homogent i en svävningsfrekvens som kan tempo av fältstimulering inom 1 och 3 Hz, jämförbar med ett friskt mänskligt hjärta. Å andra sidan, DOX-behandlade CSs följer inte den elektriska stimulering som de inte kan kontrakt. Tillsammans med mätningarna av cellernas livskraft och toxicitet med hjälp av calcein-AM och ethidium homodimer, denna funktionella assay för CS kontraktil funktion möjliggöra utvärdering av komplexa scenario typiska för det mänskliga hjärtat in vitro, för närvarande inte kan uppnås med andra modeller. Jämfört med kontraktila aktivitetsmätningar av enstaka hjärtceller med samma system kan vi inte visualisera och mäta sarkomet i CSs. Därför är vi begränsade till mätningar av % sfäroid förkortning över tiden, en analys vi var tvungna att utveckla inom vårt laboratorium. När vi kontrollerar antalet celler, vi samkultur i varje CS och därför storleken på varje CS, vi använder CSs med liknande storlek som verkligen presentera homogena kontraktil funktion. Men även i fall vi genererade CSs av olika storlekar, deras kontraktila verksamhet inte förändras.
Det är också viktigt att rapportera att den flercelliga karaktären av CSs gör dem tunga nog att lokalisera längst ner på täcket i Ion-Optix-systemet, även i fall de är superfunderade. Baserat på det faktum att CSs sitter själva i en specifik position, behöver vi inte få dem att hålla sig till täcket, tvärtom av vad som vanligen görs med enstaka hjärtceller i de flesta laboratorier.
Den mikroskopiska analysen av CSs färgas med antikroppar mot hjärt troponin T, CD31/PECAM och PECAM (som markörer för iCMs, HCAECs, och HCFs, respektive) visade bildandet av en endotelcell nätverk (Figur 1, blå). För att helt utesluta nekros i den inre delen av CSs, utfördes rumslig utvärdering av cellernas livskraft i vårt laboratorium genom confocal analys av calcein-AM/ethidium homodimer färgade CSs (data visas inte). Det är dock viktigt att erkänna att den framtida utvecklingen inom biofabriceringsområdet för att bättre rekapitulera andra komplexa funktioner som är typiska för det mänskliga hjärtat in vivo, för närvarande inte tillgänglig i den befintliga modellen. Dessa inkluderar: i) kontraktil funktion typisk för vuxna kardiomyocyter; ii) blodflödet och tryckkrafter; iii) paracrin signalering; iv) immunsvar, vilket kommer att vara avgörande för att förbättra denna och andra in vitro-hjärtmodeller6. Som någon annan modell syftar till att rekapitulera viktiga inslag i antingen en frisk vävnad eller en sjukdom tillstånd, protokollet för generering och användning av CS som beskrivs i detta manuskript syftar till att hjälpa forskaren att ta itu med specifika frågor, som kanske inte uttömmande med hjälp av denna metod. Till exempel skulle den potentiella användningen av patient-härledda celler för generering av CSs ge verktyg för personlig medicin, för närvarande inte tillgänglig med hjälp av allmänt tillgängliga högpresterande analyser för kardiovaskulär forskning.
Sammanfattningsvis visade vi ett enkelt sätt att bättre rekapitulera det mänskliga hjärtat mikromiljö med hjälp av hjärt celler. Hjärt sfäroider presentera en endotel cell nätverk som bättre rekapitulerar den som finns i det mänskliga hjärtat jämfört med monolayer kulturer av hjärtceller. Med tanke på deras unika egenskaper representerar de avancerade verktyg för in vitro-testning för kardiovaskulär forskning. Framtida studier med patient-härledda celler kan ge alternativ för personlig medicin och nya terapier för att både förebygga och bättre behandla hjärt-kärlsjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Ett särskilt tack till Nat Johnston för inspelningen och redigering av videon.
Poonam Sharma stöddes av University of Newcastle med UNIPRS och UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipendier. Carmine Gentile stöddes av en UTS Seed Finansiering, katolska ärkestiftet i Sydney Grant för adult stem cell research och en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |