Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L
Summary
Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.
Abstract
Les modèles murins jouent un rôle crucial dans la recherche sur l’arythmie et permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmagénèse, y compris la fonction altérée des canaux ioniques et la manipulation du calcium. À cette fin, des cardiomyocytes auriculaires ou ventriculaires de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp ou pour explorer les anomalies de manipulation du calcium. Cependant, le rendement limité des cardiomyocytes de haute qualité obtenus par les protocoles d’isolement actuels ne permet pas les deux mesures chez la même souris. Cet article décrit une méthode pour isoler des myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, pour des mesures simultanées ultérieures des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L d’un animal. Des cœurs de souris sont obtenus et l’aorte est rapidement canulée pour éliminer le sang. Les cœurs sont ensuite perfusés dans un premier temps avec une solution sans calcium (37 °C) pour dissocier le tissu au niveau des disques intercalés, puis avec une solution enzymatique contenant peu de calcium pour perturber la matrice extracellulaire (37 °C). Le cœur digéré est ensuite disséqué en oreillettes et ventricules. Les échantillons de tissus sont coupés en petits morceaux et dissous en pipetant soigneusement de haut en bas. La digestion enzymatique est arrêtée et les cellules sont réintroduites progressivement aux concentrations physiologiques de calcium. Après chargement avec un indicateur Ca2+ fluorescent, des cardiomyocytes isolés sont préparés pour la mesure simultanée des courants de calcium et des transitoires. De plus, les pièges d’isolement sont discutés et des protocoles de patch-clamp et des traces représentatives de courants de calcium de type L avec des mesures transitoires de calcium simultanées dans les myocytes murins auriculaires et ventriculaires isolés comme décrit ci-dessus sont fournis.
Introduction
Les arythmies cardiaques sont courantes et constituent l’un des principaux défis actuels en matière de soins de santé, car elles touchent des millions de personnes dans le monde. Les arythmies sont associées à une morbidité et une mortalité élevées 1,2 et représentent la cause sous-jacente de la majorité des morts subites cardiaques3. Les options de traitement à jour ont amélioré la survie des patients, mais sont encore principalement des traitements symptomatiques plutôt que de cibler les mécanismes sous-jacents. Ainsi, ces traitements ont une efficacité limitée et peuvent fréquemment causer des effets secondaires graves 4,5,6. Une amélioration des options de traitement actuelles nécessite un aperçu de la physiopathologie sous-jacente, ce qui crée le besoin de modèles appropriés à étudier. Les modèles de petits animaux – et en particulier les modèles murins – jouent un rôle crucial dans la recherche sur l’arythmie car ils permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse, par exemple l’impact génétique sur l’électrophysiologie cellulaire, la fonction des canaux ioniques ou la manipulation du calcium 7,8.
À cette fin, des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires isolés en quantité et viabilité suffisantes sont nécessaires. Un large éventail d’approches d’isolement différentes pour obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires a déjà été décrit 9,10,11,12,13 et certains groupes ont présenté des données provenant de mesures simultanées du courant de type L et des transitoires de calcium induits par le courant de calcium à partir d’un courant auriculaire 14 ou ventriculaire 15 cardiomyocytes murins. Cependant, à notre connaissance, il n’existe aucune donnée disponible sur les mesures auriculaires et ventriculaires d’un animal. Les chercheurs se concentrent sur une grande variété de sujets allant de l’électrophysiologie à la protéomique, en passant par les études fonctionnelles telles que la contractilité cellulaire ou les interactions protéiques, la fonction mitochondriale ou la génétique – toutes nécessitant des cardiomyocytes isolés. De nombreux protocoles publiés n’ont donc pas été spécifiquement développés pour les études de patch clamp, ce qui a conduit à des rendements limités et à une qualité cellulaire insuffisante pour les études de patch clamp. Ainsi, les mesures simultanées de patch clamp et de calcium transitoires de cellules auriculaires et ventriculaires isolées d’un animal ne peuvent pas être effectuées avec des protocoles établis.
L’isolement des myocytes murins – en particulier auriculaires – pour les expériences de patch clamp reste difficile. Cet article fournit une méthode simple et rapide pour l’isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet ensuite des mesures simultanées du courant membranaire net et des transitoires de calcium induits par le courant d’un animal. Cet article élabore un protocole pour l’isolement des myocytes auriculaires et ventriculaires dérivés de souris de type sauvage et de souris porteuses de mutations génétiques. Ce protocole peut être utilisé pour les souris mâles et femelles. L’isolement des myocytes et les images et les résultats représentatifs décrits ci-dessous ont été obtenus à partir de souris sauvages de type C57Bl/6 à l’âge de 6 (± 1) mois. Néanmoins, ce protocole a été utilisé avec succès pour des souris de différents âges allant de 2 à 24 mois avec différents génotypes. La figure 1 montre la configuration de l’isolement et un gros plan d’un cœur canulé pendant la perfusion enzymatique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article fournit un moyen simple et fonctionnel d’obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires de haute qualité à partir de la même souris pour des études patch-clamp avec des enregistrements transitoires de calcium simultanés. La qualité des données obtenues dépend fortement de la qualité de l’isolement cellulaire. Comme mentionné ci-dessus, de nombreuses méthodes pour isoler les cardiomyocytes murins ont été décrites précédemment 9,10,11,12.<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 à P. Tomsits et D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 et SFB1002 projet A13 à N. Voigt), Fondation allemande pour la recherche dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne (EXC 2067/1- 390729940 à N. Voigt), Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss et N. Voigt; 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss) et la Fondation Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 à N. Voigt). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Referências
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