Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Summary

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l’enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l’elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

Le infezioni ricorrenti del tratto urinario (rUTI) causate da Escherichia coli uropatogeno (UPEC) sono comuni e costose. Articoli precedenti che descrivono modelli di UTI in topi maschi e femmine hanno illustrato le procedure per l’inoculazione batterica e l’enumerazione nelle urine e nei tessuti. Durante un’infezione iniziale della vescica nei topi C57BL/6, l’UPEC stabilisce serbatoi latenti all’interno delle cellule epiteliali della vescica che persistono dopo la clearance della batteriuria UPEC. Questo modello si basa su questi studi per esaminare rUTI causata dall’emergere di UPEC dall’interno di serbatoi vescicali latenti. Il batterio urogenitale Gardnerella vaginalis è usato come innesco della rUTI in questo modello perché è frequentemente presente nei tratti urogenitali delle donne, specialmente nel contesto della disbiosi vaginale che è stata associata a UTI. Inoltre, viene descritto anche un metodo per la fissazione della vescica in situ seguito dall’analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) del tessuto vescicale, con potenziale applicazione ad altri studi che coinvolgono la vescica.

Introduction

Le infezioni del tratto urinario (UTI) impongono un onere sanitario significativo in tutto il mondo, influenzando la qualità della vita di milioni di persone ogni anno, in particolare le donne¹. L’Escherichia coli uropatogeno (UPEC) è la causa più frequente di UTI¹. Molti pazienti (circa il 20-30%) che sviluppano UTI sperimenteranno una UTI ricorrente (rUTI) entro 6 mesi nonostante la clearance mediata da antibiotici dell’infezione iniziale². Sfortunatamente, ben il 5% delle donne in premenopausa soffre di 3 o più rUTI ogni anno ^3,4. Gli episodi sequenziali di rUTI possono essere causati dalla persistenza dello stesso ceppo UPEC dal caso indice 5,6,7,8. I dati provenienti da campioni umani e modelli murini suggeriscono che la rUTI dello stesso ceppo potrebbe essere causata da UPEC che risiede all’interno di serbatoi quiescenti nella vescica. Nell’uomo, UPEC è stato rilevato in cellule epiteliali e biopsie della vescica di pazienti con UTI 9,10,11,12,13. Studi su topi C57BL/6 hanno dimostrato che alcuni ceppi di UPEC possono stabilire serbatoi intracellulari quiescenti nella vescica, come rilevato dalla microscopia a fluorescenza e dall’omogeneizzazione e coltura del tessuto vescicale, che vengono mantenuti per mesi dopo la risoluzione della batteriuria 14,15,16. Il trattamento della vescica con agenti che inducono l’esfoliazione dell’epitelio vescicale (urotelio), ad esempio protamina solfato¹⁷ o chitosano¹⁸, innescano la comparsa di UPEC dai serbatoi per causare rUTI. Questi dati suggeriscono che nelle donne che ospitano serbatoi UPEC della vescica da una precedente infezione, le esposizioni della vescica che portano all’esfoliazione uroteliale possono innescare rUTI.

Ci sono prove crescenti che il microbiota vaginale contribuisce all’infezione del tratto urinario^19,20. Gardnerella vaginalis è un membro frequente del microbiota vaginale e urinario 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Nella vagina, la presenza di alti livelli di G. vaginalis è associata a una disbiosi microbica nota come vaginosi batterica (BV), che colpisce ~ 30% delle donne 30,31,32. Le donne con BV sono a più alto rischio di sperimentare UTI rispetto alle donne con una comunità vaginale dominata da Lactobacillus 33,34,35,36,37. Nei modelli murini, G. vaginalis provoca esfoliazione epiteliale sia nella vagina³⁸ che nella vescica³⁹. Nei topi C57BL/6 che ospitano serbatoi della vescica UPEC, due esposizioni sequenziali della vescica a G. vaginalis – ma non a PBS – provocano il riemergere di UPEC dai serbatoi per causare UPEC rUTI. L’emergere è evidenziato dalla comparsa di titoli UPEC nelle urine di topi che avevano precedentemente risolto la batteriuria UPEC e una successiva diminuzione dei titoli di omogeneizzati della vescica UPEC al sacrificio rispetto agli animali di controllo esposti a PBS³⁹. È interessante notare che non esiste una colonizzazione duratura da parte di G. vaginalis nella vescica. Nella stragrande maggioranza dei casi, due brevi esposizioni, ciascuna con meno di 12 (h) di G. vaginalis vitale nelle urine, sono sufficienti per provocare l’esfoliazione uroteliale e promuovere la rUTI.

Questo protocollo descrive un modello murino di rUTI causato da UPEC che risiede nei serbatoi della vescica intracellulare, utilizzando l’inoculazione della vescica di G. vaginalis per innescare la recidiva. Il progresso ottenuto da questo modello è che G. vaginalis è un trigger biologico clinicamente rilevante di rUTI rispetto agli agenti chimici precedentemente utilizzati. Inoltre, la sopravvivenza relativamente breve di G. vaginalis nel tratto urinario del topo consente di esaminare l’impatto delle esposizioni microbiche transitorie sull’urotelio, come potrebbe verificarsi dopo l’attività sessuale. Oltre a delineare il modello rUTI, questo protocollo descrive anche i metodi per la citologia delle urine e la fissazione della vescica in situ e l’imaging dell’urotelio mediante microscopia elettronica a scansione (SEM).

Questo protocollo di UPEC UTI ricorrente indotto da G. vaginalis utilizza il ceppo UPEC UTI89 con una cassetta di resistenza alla kanamicina (UTI89^kanR)⁴⁰. Non tutti i ceppi di UPEC testati sono stati in grado di formare comunità batteriche intracellulari durante la fase di infezione acuta nei topi⁴¹ e non è ancora noto se tutti i ceppi di UPEC abbiano la capacità di formare serbatoi intracellulari latenti. La formazione del serbatoio deve essere confermata prima dell’uso di altri ceppi UPEC nel modello. Questo protocollo utilizza un isolato spontaneo di G. vaginalis resistente alla streptomicina, JCP8151B^SmR38. L’induzione di rUTI da parte di JCP8151B^SmR richiede due inoculazioni sequenziali di G. vaginalis , date 12 ore o 7 giorni (d) a parte³⁹. Se altri ceppi di G. vaginalis inducano o meno esfoliazione e/o UPEC rUTI rimane da determinare con questo modello. È essenziale utilizzare ceppi UPEC e G. vaginalis con resistenza agli antibiotici nota (come kanamicina o spectinomicina per UPEC e streptomicina per G. vaginalis) perché gli antibiotici possono essere aggiunti alle piastre di agar per prevenire la crescita del microbiota endogeno di topo che potrebbe altrimenti interferire con l’enumerazione delle unità formanti colonie (CFU) per monitorare l’infezione. Questo è particolarmente importante per la coltura di campioni di urina, perché l’urina di topo contiene spesso altri batteri che possono crescere troppo su piastre di coltura senza antibiotici. L’origine di questi batteri endogeni nelle urine dei topi è sconosciuta, ma probabilmente riflette i batteri periuretrali e urogenitali raccolti durante la raccolta delle urine.

G. vaginalis è un batterio anaerobico facoltativo e, pertanto, questo protocollo descrive la crescita di G. vaginalis JCP8151B^SmR in una camera anaerobica. Se non è disponibile una camera anaerobica, è possibile utilizzare altri metodi per mantenere le condizioni di crescita anaerobica (come una sacca GasPak in un contenitore ermetico). In alternativa, alcuni ceppi di G. vaginalis (tra cui JCP8151B^SmR) cresceranno in un incubatore standard di coltura tissutale (5% CO₂). Proprio come l’uso di ceppi di G. vaginalis diversi da JCP8151B^SmR richiede test per garantire che i batteri si comportino in modo simile in questo modello, il cambiamento delle condizioni di crescita richiede la determinazione empirica delle durate ideali per la coltura (su piastre e in liquido) e la densità ottica (OD) ₆₀₀ equivalenti per ottenere le concentrazioni di inoculo vitali desiderate. Inoltre, non è noto se le condizioni di crescita influenzino la patobiologia di G. vaginalis.

Infine, quando si considera se utilizzare questo modello, i ricercatori dovrebbero essere consapevoli del fatto che può richiedere un numero maggiore di animali per gruppo rispetto ai tipici modelli murini UTI. Ciò è in parte dovuto al fatto che l’induzione di rUTI richiede che i topi risolvano la batteriuria UPEC causata dall’infezione iniziale della vescica. Pertanto, qualsiasi topo che non riesce a eliminare la batteriuria (un fenotipo solitamente indicativo di infezione renale in corso) non è incluso nella fase rUTI del protocollo. Il numero di topi necessari per alimentare questi studi è anche influenzato dal tasso di emergenza “spontanea” di UPEC nelle urine (12-14% in media). Infine, diversi ceppi di topo hanno diverse propensioni allo sviluppo di batteriuria cronica rispetto alla formazione di serbatoi intracellulari^42,43. Se si utilizzano ceppi di topo diversi da C57BL/6 in questo modello, deve essere confermato che gli animali sviluppano serbatoi intracellulari UPEC quiescenti.

Protocol

Il Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ha approvato tutte le infezioni e le procedure del topo come parte del numero di protocollo 20170081, scaduto il 09/06/2020, e 20-0031, che scade il 18/03/2023. La cura generale degli animali era coerente con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche e la Guida alle risorse per la cura degli animali dell’USDA. Le procedure di eutanasia sono coerenti con le linee guida AVMA per l’eutanasia degli animali: edizione 2020. Figura 1. Schema del modello del mouse. La sequenza temporale viene evidenziata per riflettere le fasi o le procedure del modello delineate nel protocollo. Fase 1 (arancione): Creazione di serbatoi UPEC intracellulari. I topi vengono inoculati transuretralmente con UPEC e i campioni di urina vengono raccolti e monitorati per la clearance della batteriuria. Solo i topi che eliminano la batteriuria procedono alle fasi successive. Fase 2 (verde): Esposizione della vescica a G. vaginalis. I topi vengono inoculati transuretralmente con G. vaginalis due volte. La durata del tempo tra le due esposizioni sequenziali è di 12 ore (pannello superiore) o 1 settimana (settimana; pannello inferiore), a seconda dell’analisi a valle desiderata. Fase 3 (giallo): UPEC rUTI. L’urina viene raccolta quotidianamente dopo l’esposizione a G. vaginalis e monitorata per la batteriuria UPEC. Inoltre, vesciche e reni possono essere raccolti all’endpoint sperimentale per misurare i titoli tissutali UPEC. Nel modello di esposizione a 1 settimana, l’emergere di UPEC indotto da G. vaginalis dai serbatoi intracellulari e la successiva clearance dal tratto urinario si riflettono anche in una diminuzione dei titoli del tessuto vescicale UPEC (rispetto ai topi esposti a PBS, vedere Figura 3D). Questa diminuzione dei titoli della vescica non era evidente nel modello di esposizione di 12 ore, presumibilmente perché è necessario più tempo per l’emergenza e la clearance sufficienti del serbatoio per ridurre significativamente i titoli dei tessuti. Procedura A: La citologia delle urine viene in genere eseguita a 1 dpi (o anche prima) durante la fase 1 per esaminare l’infezione acuta da UPEC e durante la fase 3 per valutare il contenuto di PMN nelle urine, che è correlato all’emergenza UPEC. I campioni di urina raccolti in altri punti temporali possono essere analizzati in modo simile. Procedura B: La microscopia elettronica a scansione della vescica (SEM) per esaminare l’esfoliazione uroteliale viene tipicamente eseguita nel modello 12 h a 3 h dopo la seconda esposizione a G. vaginalis (15 h dopo la somministrazione della prima esposizione al tempo 0). Possono essere valutati anche altri punti temporali, come 6-24 ore dopo l’inoculazione UPEC come mostrato nella Fase 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. Stabilire serbatoi intracellulari quiescenti UPEC nei topi Preparare i cateteri urinari (fare riferimento a 44,45,46,47 per i video di questo passaggio). Filettatura 30 Aghi calibro con una lunghezza di tubo in PE10 che si estende dalla base dell’ago a diversi mm oltre la punta dell’ago. Fare attenzione a non forare il tubo con la punta dell’ago. In alternativa, utilizzare cannule pediatriche per via endovenosa46. Posizionare i cateteri preparati in una capsula di Petri e sterilizzare con luce UV per almeno 30 minuti. Sostituire il coperchio della capsula di Petri e fissare per la conservazione fino a quando necessario. Preparare l’inoculo UPEC (giorno da -3 a 0) Giorno -3: Striscia UTI89kanR da -80 °C di brodo congelatore su una piastra di agar Luria-Bertani (LB). Incubare la piastra a 37 °C per 18-24 h.NOTA: Non è necessario aggiungere kanamicina al mezzo di crescita dell’inoculo perché la resistenza alla kanamicina è stabilmente integrata in UTI89kanR. Giorno -2: Inoculare 20 mL di brodo LB in un matraccio sterile da 125 mL con una singola colonia di UTI89kanR. Non utilizzare un pallone più piccolo perché questo metodo di coltura è importante per indurre l’espressione del pilus UPEC di tipo 1 necessario per l’adesione della vescica. Incubare staticamente (senza agitare) a 37 °C per 18-24 ore. Non aggiungere antibiotici al terreno di crescita. Utilizzare solo colonie fresche su piastre LB (18-24 ore) per avviare colture liquide. Giorno -1: Sottocoltura UTI89kanR rimuovendo 20 μL di coltura (ruotare delicatamente il pallone per risospese i batteri sedimentati) e aggiungendo a 20 ml di brodo LB fresco in un matraccio sterile da 125 ml. Incubare come nel passaggio 2, ad eccezione di una durata ferma di 18 ore. Non aggiungere antibiotici al terreno di crescita. Giorno 0: Trasferire l’intera coltura in un tubo da 50 ml e ruotare a 3200 × g in una centrifuga da tavolo per 10 minuti ai batteri del pellet. Aspirare il surnatante e risospesare il pellet batterico in 10 ml di PBS. Aggiungere 100 μL della sospensione batterica concentrata dallo stadio 4 a 900 μL di PBS in una cuvetta e determinare la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro che è stato oscurato con PBS. Moltiplicare il valore dello spettrofotometro per 10 (per tenere conto della diluizione) per determinare l’OD600 della sospensione (sospensione OD). Per ottenere la concentrazione di inoculo desiderata di 1 x 107 CFU in 50 μL, diluire (o concentrare) la sospensione UTI89kanR utilizzando la seguente equazione, in cuil’inoculo OD desiderato è 0,35 (il valore può variare per altri ceppi UPEC) e Y è il volume di inoculo richiesto (100 μL per topo per consentire un extra per eliminare bolle e riempire i cateteri):X mL xsospensione OD = Y mL xinoculo ODAd esempio, se il valore dellasospensione OD è 4,7 e sono necessari 5 mL di inoculo:X mL × 4,7 = 5 × 0,35X = (5 × 0,35) / 4,7X = 0,372 mlPertanto, aggiungere 372 μL di sospensione batterica per ottenere 5 mL (volume finale) Utilizzare una pipetta multicanale per effettuare diluizioni seriali 1:10 dell’inoculo a 10-6 in PBS sterile in una piastra a 96 pozzetti. Individuare cinque repliche da 10 μL di tutte e 6 le diluizioni su una piastra LB e LB+kan, lasciare asciugare le macchie e incubare a 37 °C durante la notte. La piastra LB senza antibiotici viene utilizzata per garantire che l’inoculo non sia contaminato da un altro organismo (che apparirebbe come una morfologia aggiuntiva della colonia non presente sulla piastra di selezione degli antibiotici kan). Entrambi i tipi di piastra dovrebbero produrre lo stesso risultato.NOTA: le piastre devono essere lasciate asciugare sul banco per un giorno prima dell’uso in modo che assorbano il liquido placcato senza macchie coalescenti. Contare il numero totale di colonie in tutti i punti della diluizione con colonie distinguibili e utilizzare il valore per calcolare la dose effettiva di inoculo utilizzata in ciascun esperimento. Non fare semplicemente affidamento sui valori OD600 . Inoculare UTI89kanR nelle vesciche di topi femmina anestetizzati (Giorno 0)NOTA: Le registrazioni video di questa procedura sono state pubblicate in precedenza44,46. Fare riferimento a questi documenti per una descrizione più approfondita. Vedere la sezione 5 di questo protocollo per maggiori dettagli sul cateterismo del topo. Anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano secondo i metodi approvati dalla IACUC. Mentre aspetti che i topi vengano anestetizzati, riempi la siringa di tubercolina con l’inoculo UTI89kanR e poi apponi un catetere preparato. Premere lo stantuffo per svuotare l’aria dal catetere, quindi tamponare il catetere in lubrificante chirurgico sterile. Posizionare il mouse sul retro e confermare l’anestesia spremendo saldamente la pedana del mouse e osservando l’assenza di un riflesso o di una risposta. Individua la vescica (si sente come un pisello nell’addome inferiore) tra gli indici di ogni mano. Esprimere l’urina muovendo le dita l’una verso l’altra per applicare una leggera pressione di spremitura alla vescica. Inserire il catetere attraverso l’uretra del topo nella vescica e fornire lentamente 50 μL di inoculo. Attendere qualche secondo e poi rimuovere delicatamente il catetere tirando dritto fuori. Riportare il mouse nella sua gabbia e monitorarlo fino a quando non si riprende dall’anestesia. Ripetere i passaggi 1.3.1 – 1.3.5 con topi aggiuntivi, cambiando il catetere tra ogni gabbia (5 topi). Se lo si desidera, la stessa procedura può essere utilizzata per inoculare un gruppo di controllo di topi con PBS, ad esempio per mostrare un altro ceppo di G. vaginalis suscita rUTI (oltre il livello spontaneo / di fondo). 2. Clearance di monitoraggio della batteriuria UPEC (giorni da 1 a 28) NOTA: Il video della procedura di raccolta delle urine è stato pubblicato in precedenza44. Raccogliere l’urina (minimo 10 μL) da tutti i topi mediante palpazione della vescica come descritto44 a 1 d dopo l’infezione e settimanalmente per 4 settimane (7, 14, 21 e 28 d dopo l’infezione). L’urina deve essere coltivata entro poche ore dalla raccolta al fine di monitorare l’infezione da UPEC. Conservare l’urina a 4 °C fino a quando non è placcata. L’urina può essere utilizzata anche per la citologia (vedere paragrafo 4). Occasionalmente se la vescica è molto infiammata, non è possibile ottenere 10 μL di urina; in questo caso pbS può essere aggiunto fino a 10 μL, ma il titolo batterico delle urine e i punteggi di citologia devono essere regolati di conseguenza (ad esempio, se vengono raccolti solo 5 μL di urina e vengono aggiunti 5 μL di PBS, moltiplicare titoli e punteggi per 2). Con una pipetta multicanale, effettuare diluizioni seriali 1:10 a 10-6 in PBS sterile in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta multicanale P10 per individuare 10 μL di tutte e 6 le diluizioni della colonna 1 in orientamento verticale sul bordo sinistro di una piastra LB contenente il marcatore di selezione antibiotico pertinente. Scartare le punte. Ripetere la placcatura con i campioni rimanenti (colonna 2, quindi colonna 3, ecc.). Una singola piastra può ospitare 5 campioni affiancati. Questo produce una piastra con una matrice a 5 × 6 punti, con diluizioni crescenti dall’alto verso il basso e numeri di campioni crescenti da sinistra a destra (Figura 2A). Lasciare asciugare le macchie sul banco, quindi incubare a 37 °C durante la notte. Il giorno successivo, contare il numero di colonie nel punto meno diluito in cui le colonie sono distinte (Figura 2B) e utilizzare questo numero per calcolare CFU/mL:# di colonie in singolo punto urinario × fattore di diluizione × 100 = CFU/mL di urina Traccia i titoli delle urine UTI89kanR utilizzando un software grafico (Figura 2C). Identificare i topi che non hanno UTI89kanR rilevabile nelle urine a 28 d (~ 65-80% dei topi C57BL / 6). Questi topi ospitano serbatoi intracellulari quiescenti e vengono utilizzati nella successiva fase sperimentale per esaminare l’induzione di UTI ricorrenti. Quelli con batteri nelle urine a 28 d non sono inclusi nei passaggi successivi. 3. Esposizioni della vescica a G. vaginalis Assegnare i topi ai gruppi di esposizione (Giorno 29). L’obiettivo principale di questo passaggio è quello di evitare di avere tutti i topi con batteriuria più prolungata insieme nello stesso gruppo di esposizione, poiché non è noto se ciò influenzi la probabilità di rUTI. Utilizzando i dati CFU delle urine (Figura 2D), classificare i topi in base al punto temporale in cui la batteriuria UTI89kanR non era più rilevabile (Figura 2E). Randomizzare i topi di ciascuna categoria nei gruppi di inoculazione G. vaginalis o PBS; ad esempio, metà dei topi che hanno eliminato prima del giorno 7 ottengono G. vaginalis e metà riceveranno PBS; metà dei topi che hanno eliminato tra i giorni 8 e 14 otterranno G. vaginalis e metà riceverà PBS, ecc. (come nella Figura 2E). Preparare l’inoculo di G. vaginalis (tutti i passaggi eseguiti in una camera anaerobica)NOTA: I tempi ideali di incubazione della coltura variano tra i diversi ceppi di G. vaginalis, con alcuni ceppi che entrano nella fase stazionaria e iniziano persino a morire più rapidamente di altri. Ciò è particolarmente importante dato che G. vaginalis ucciso (JCP8151B) non è stato in grado di innescare rUTI39. Pertanto, i tempi di incubazione dovrebbero essere determinati empiricamente per un determinato ceppo prima di eseguire esperimenti sui topi. Non è noto se altri/tutti i ceppi di G. vaginalis innescheranno gli stessi effetti in questo modello. Striscia G. vaginalis ceppo da -80 °C brodo congelatore su una piastra NYCIII (senza antibiotici). Incubare la piastra a 37 °C anaerobicamente per 24 ore. Nella camera anaerobica, inoculare 5 mL di mezzi anaerobici NYCIII con un loop di cellule da 1 μL (una singola colonia è insufficiente) dalla piastra NYCIII e incubare la coltura staticamente a 37 °C in condizioni anaerobiche per 18 ore. Non includere antibiotici nel mezzo di crescita. Determinare l’OD600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro. Centrifugare un volume definito (X) di coltura a 9600 × g per 1 minuto e aspirare il mezzo. Calcolare il volume (Y) di PBS per ri-sospendere il pellet per ottenere l’OD dell’inoculo desiderato per ottenere 108 CFU in 50 μL utilizzando la seguente equazione:X mL × ODcoltura = Y mL ×inoculo OD risolvere per YY = (X ml ×coltura OD) /inoculo ODNOTA:L’inoculo OD per JCP8151BSmR è 5, ma questo deve essere determinato empiricamente per altri ceppi di G. vaginalis . Ad esempio, se si girano 3 mL di una coltura liquida notturna JCP8151BSmR concoltura OD = 2.0: Y= (3 mL × 2.0) / 5.0; quindi ricaspesare il pellet in 1,2 ml di PBS Sospendere il pellet batterico in PBS alla concentrazione desiderata. Diluire e placcare in serie l’inoculo (come descritto nel protocollo di placcatura CFU sopra) per determinare la dose effettiva di inoculo che è stata utilizzata in ciascun esperimento. Non fare semplicemente affidamento sui valori OD. Il giorno 29-31 dopo l’inoculazione UPEC, inoculare topi anestetizzati con G. vaginalis o PBS come descritto nel passaggio 1.3 sopra. Un gruppo di controllo PBS è essenziale, in quanto l’atto di cateterizzare la vescica potrebbe indurre danni ed esfoliazione uroteliale che potrebbero provocare un certo grado di riemergere del serbatoio UPEC. I topi inoculati con PBS servono quindi come controllo a cui vengono confrontati i topi inoculati con G. vaginalis.NOTA: La determinazione finale della batteriuria UPEC a 28 d richiede l’incubazione notturna della piastra CFU. Pertanto, il primo passaggio che può essere eseguito è 29 giorni dopo l’inoculazione UPEC iniziale. Se necessario, l’esposizione potrebbe essere data fino al giorno 31. I ricercatori dovrebbero essere coerenti tra gli esperimenti. Ripetere la preparazione dell’inoculo per somministrare una seconda inoculazione di G. vaginalis (o controllo PBS) nel punto temporale desiderato, ad esempio 12 ore o 1 settimana dopo la prima inoculazione. Una seconda esposizione è necessaria perché una singola inoculazione con G. vaginalis non comporta una significativa emergenza UPEC39. 4. Monitoraggio dell’UTI ricorrente UPEC Raccogliere l’urina dai topi nei punti temporali desiderati dopo ogni inoculazione di G. vaginalis (1, 2 e 3 d post-inoculazione raccomandata). Diluire in serie e piallare l’urina su piastre selettive (ad esempio, LB + kanamicina) per determinare UTI89kanR CFU / mL. Se lo si desidera, le diluizioni urinarie possono anche essere placcate su piastre selettive (ad esempio, NYCIII + 1 mg / mL di streptomicina) per determinare G. vaginalis CFU / mL. Tuttavia, G. vaginalis JCP8151BSmR è stato eliminato dalle urine della maggior parte dei topi entro 12 ore 39. Pertanto, sarebbero necessari punti temporali precedenti per rilevare G. vaginalis nella maggior parte dei topi. All’endpoint sperimentale (ad esempio, 3 d dopo la seconda inoculazione di G. vaginalis), sacrificare i topi secondo metodi approvati (ad esempio, lussazione cervicale in anestesia isoflurano o inalazione di CO2) e raccogliere vesciche e reni per l’enumerazione CFU, come descritto in precedenza 44,46. 5. Citologia delle urine NOTA: Questa procedura può essere eseguita in qualsiasi momento in cui si desidera la visualizzazione delle cellule e/o dei batteri presenti nelle urine. Come indicato nella Figura 1, la citologia delle urine viene in genere eseguita a 1 dpi (o anche prima) durante la Fase 1 per esaminare l’infezione acuta da UPEC e durante la Fase 3 per valutare la presenza di cellule polimorfonucleate (PMN) nelle urine che mostrano l’emergenza UPEC. Aggiungere 10 μL di urina a 90 μL di PBS in una cassetta di citofunne con filtro e vetrino collegati. (Il metodo più semplice consiste nell’utilizzare il resto delle diluizioni 1:10 dalla piastra a 96 pozzetti utilizzata per la coltura delle urine; questi campioni possono essere utilizzati fino a 24 ore dopo la coltivazione delle urine se conservati a 4 °C). Posizionare le cassette in citocentrifiva e ruotare a 600-800 x g per 6 minuti con alta accelerazione. Rimuovere le diapositive e lasciare asciugare durante la notte. Il giorno dopo, macchiare con un kit di colorazione ematologica (ad esempio, Wright’s, Giemsa, incluso fissativo) secondo il protocollo del produttore. Analizzare i vetrini al microscopio ottico per la presenza di PMN e cellule epiteliali. Se lo si desidera, questi possono essere valutati utilizzando una metrica di punteggio qualitativo basata sull’abbondanza di ciascun tipo di cella presente in ciascun campo visivo ad alta potenza (ad esempio, 0 = nessuno, 1 = pochi, 2 = moderato, 3 = robusto). Assicurarsi che l’individuo che analizza le diapositive sia accecato ai gruppi sperimentali per ridurre al minimo i potenziali pregiudizi. 6. Imaging delle vesciche mediante microscopia elettronica a scansione NOTA: questa procedura può essere eseguita in qualsiasi momento in cui si desidera la visualizzazione dell’urotelio. Come indicato nella Figura 1 (scatole viola), le interazioni UPEC-uroteliale sono meglio visualizzate tra 6 h e 24 h dopo l’inoculazione UPEC durante la fase di formazione del serbatoio, e l’esfoliazione uroteliale innescata da G. vaginalis è meglio visualizzata tra 3 h e 12 h dopo la seconda esposizione a G. vaginalis . Fissazione della vescica in situ Preparare il fissativo immediatamente prima della raccolta della vescica aggiungendo glutaraldeide (2,5% finale) e paraformaldeide (2% finale) in tampone cacodilato di sodio da 0,15 M con 2 mM di CaCl2 a pH 7,4. Utilizzare paraformaldeide e glutaraldeide da fiale di vetro appena aperte, poiché entrambi i fissativi si ossidano nel tempo in contenitori aperti.ATTENZIONE: La glutaraldeide è tossica, irritante per le vie respiratorie e corrosiva; la paraformaldeide è infiammabile, cancerogena, irritante e tossina riproduttiva; il cacodilato di sodio è tossico e cancerogeno. Per produrre 50 mL di soluzione fissativa, aggiungere 6,25 mL di paraformaldeide al 16%, 2 mL di glutaraldeide al 50% e 16,75 mL di acqua ultrapura a 25 mL di una soluzione da 0,3 M di cacodilato di sodio a pH 7,4 con 4 mM CaCl2. Riscaldare il fissativo preparato a 37 °C prima della somministrazione alle vesciche. Riempire la siringa a punta di scivolamento della tubercolina con fissativo e apporre un catetere all’estremità, smussato di fronte ai segni della siringa opposta. Tagliare il tubo in eccesso a 1-2 mm dall’estremità dell’ago, facendo attenzione a non esporre la punta dell’ago. Far scorrere la siringa per rimuovere le bolle e spingere lo stantuffo per svuotare l’aria e riempire il catetere con fissativo su un tubo microcentrifuga per raccogliere qualsiasi fissativo per un corretto smaltimento. Anestetizzare e sacrificare il topo utilizzando un metodo approvato (ad esempio, lussazione cervicale in anestesia). Posizionare il mouse sulla superficie di dissezione con le gambe fissate (con elastici o perni). Aprire l’area pelvica del topo con una pinza e un paio di forbici chirurgiche per esporre la vescica. Spingere con attenzione da parte il grasso adiacente ma lasciare la vescica in posizione. Tenga la siringa con la mano dominante con l’ago rivolto verso il basso e la smussatura dell’ago e i segni della siringa rivolti verso di lei. Immergere la punta del catetere in lubrificante sterile. Posizionare la punta del catetere all’apertura uretrale, tenendo lontano la canna della siringa posizionata con un angolo di 30-45° sul corpo del mouse. Applicare una pressione verso il basso con un movimento in senso orario molto piccolo con la punta e inserire delicatamente il catetere nell’uretra. Quando la punta del catetere entra nell’uretra, incernierare la siringa verso la coda del topo continuando a far scorrere ulteriormente il catetere nell’uretra fino a quando la canna della siringa è parallela alla superficie di lavoro. L’intero albero dell’ago del catetere (esclusa la base) deve entrare nel mouse, posizionando la punta del catetere all’interno del lume della vescica. Erogare lentamente 50-80 μL di fissativo, facendo gonfiare la vescica come un palloncino. Tenere il catetere in posizione e sollevare leggermente la siringa, inclinando la punta verso l’alto. Con l’altra mano, aprire un emostato e far scorrere una punta sotto l’ago del catetere all’intersezione dell’uretra. Chiudere parzialmente l’emostato fino a quando non entra in contatto con l’ago. Far scorrere delicatamente l’ago del catetere fuori dalla vescica mentre contemporaneamente blocca e blocca completamente l’emostato per prevenire la perdita del fissativo. Afferrare l’emostato in modo che sia parallelo alla superficie di lavoro con la vescica appoggiata sopra. Sollevare delicatamente e tagliare con cura sotto l’emostato (lato opposto della vescica) per rimuovere la vescica con l’emostatico ancora attaccato. Posizionare la vescica e l’emostato attaccato in un tubo Falcon contenente fissativo riscaldato. Assicurarsi che la vescica sia completamente immersa nel fluido e non premuta contro le pareti del tubo. Incubare a 4 °C per 24 ore. Elaborazione della vescica e imaging con microscopia elettronica a scansione (SEM) Tagliare sagittalmente la vescica con una lama di rasoio a doppia faccia pulita e fare un secondo taglio tangenziale all’emostato per rilasciare la vescica. Ciò si traduce in 2 “tazze” a mezza vescica. Se esistono cuscinetti di grasso rimanenti all’esterno della vescica, rimuoverli delicatamente. Risciacquare le metà della vescica tre volte (10 minuti ciascuna) in tampone cacodilato di sodio (0,15 M, pH 7,4). Macchiare il tessuto con tetrossido di osmio all’1% in tampone cacodilato da 0,15 M per 1 ora a temperatura ambiente. L’osmio è sensibile alla luce; pertanto, eseguire questo passaggio con il recipiente di colorazione avvolto in un foglio per mantenere un ambiente buio.ATTENZIONE: Il tetrossido di osmio è tossico e corrosivo per la pelle. Fai questo passaggio nel cappuccio dei fumi con i guanti. Risciacquare le metà della vescica tre volte (10 minuti ciascuna) in acqua ultrapura. Durante questi passaggi, l’olio osmicato può a volte essere visto sulla superficie dell’acqua. Aspirare o stoppare questo per evitare la contaminazione durante le fasi di asciugatura. Disidratare i tessuti immergendoli in una serie di etanolo graduato (50, 70, 90, 100 e 100%) per 10 minuti ciascuno. Asciugare il tessuto fisso utilizzando un essiccatore a punto critico che esegue12 scambi di CO 2 alla velocità più lenta. Impostare tutte le impostazioni aggiuntive su lento, ad eccezione del passaggio di ventilazione che è impostato su veloce. Taglia di nuovo in due ogni metà della vescica con un rasoio bifacciale pulito per generare 4 pezzi totali per ridurre la curvatura del campione per un rivestimento più efficiente, per facilitare l’imaging nel SEM e per esporre il tessuto che potrebbe essersi arricciato durante l’essiccazione. Far aderire i pezzi della vescica a una linguetta adesiva in carbonio conduttivo su un mozzicone di alluminio e dipingere una piccola quantità di adesivo d’argento intorno al fondo contatto con uno stuzzicadenti, avendo cura di evitare che l’adesivo in eccesso si trasmetta sulla superficie interna della vescica. Utilizzare un coater sputter ad alto vuoto per sputter rivestire gli stub del campione con 6 nm di iridio. Se i campioni continuano a caricarsi, assicurarsi che un percorso conduttivo sia verniciato verso la superficie con vernice argentata e rivestire con ulteriori 4 nm di iridio. Immagina i campioni con un microscopio elettronico a scansione. Mentre le condizioni possono variare a seconda del microscopio utilizzato, una tensione di accelerazione di 3 KeV con una corrente del fascio di 200 pA e una distanza di lavoro di 12-13 mm ha funzionato bene su un Zeiss Merlin FE-SEM quando si utilizza il rivelatore di elettroni Everhart-Thornley (SE2).

Representative Results

Dopo l’inoculazione, i titoli UPEC sono rilevabili nelle urine (Figura 2B). La mancata placcatura di campioni di urina su mezzi selettivi contenenti kanamicina comporterà probabilmente una crescita eccessiva del microbiota endogeno di topo che contamina l’urina. Il livello di batteriuria UPEC sarà probabilmente elevato il giorno 1 e potrebbe aumentare durante la prima settimana prima di diminuire in momenti successivi (Figura 2C). Circa il 65-80% dei topi non avrà UPEC rilevabile nelle urine di 28 dpi (Figura 2C, cerchio verde). Questi topi possono essere utilizzati nelle fasi successive del modello. I topi che rimangono batteriurici (Figura 2C, ellisse rossa) dovrebbero essere eliminati dall’esperimento. Due esposizioni sequenziali a G. vaginalis somministrate a 12 ore (Figura 3A) o 1 settimana di distanza (Figura 3B) provocano l’emergere di UPEC dai serbatoi intracellulari per causare batteriuria ricorrente. Sia il livello di batteriuria UPEC (test di Mann-Whitney) che la frazione di topi che mostrano UPEC rUTI (test esatto di Fisher) sono significativamente più alti nei topi esposti a G. vaginalis rispetto al gruppo di controllo PBS. L’analisi citologica delle urine rileva PMN nelle urine di topi esposti a G. vaginalis che hanno mostrato l’emergenza UPEC (Figura 3C). Nel modello con due esposizioni date a 1 settimana di distanza, i titoli UPEC nel tessuto vescicale sono più bassi nei topi esposti a G. vaginalis rispetto a PBS (Figura 3D), presumibilmente a causa dell’emergere di UPEC dai serbatoi e della successiva clearance. La visualizzazione del tessuto vescicale fissato in situ da parte di SEM rivela grandi cellule uroteliali superficiali ombrello che rivestono la superficie della vescica in topi di controllo esposti solo a PBS (Figura 4A). L’esfoliazione uroteliale è evidenziata da una perdita di cellule ombrello superficiali, che rivelano cellule epiteliali transizionali sottostanti più piccole nei topi esposti a G. vaginalis (Figura 4B). All’inizio dopo l’inoculazione UPEC durante la creazione di serbatoi intracellulari, gli UPEC sono visibili sull’urotelio e filamentano dalle cellule esfolianti (Figura 4C). Figura 2. Monitoraggio dei titoli UPEC nelle urine durante la fase 1 (formazione del serbatoio). (A) Schema della placcatura delle unità formanti colonie (CFU). (B) Immagine rappresentativa dei titoli UPEC nelle urine su LB+kanamicina. I cerchi neri indicano macchie di campioni di urina che devono essere contate per calcolare CFU / mL. (C) Decorso temporale della batteriuria UPEC nei topi C57BL/6. Ogni linea rappresenta un singolo topo, tracciando i titoli delle urine UPEC nel tempo. La linea tratteggiata indica il limite di rilevazione (1000 CFU/mL). L’ellisse rossa indica quattro topi (su 20) che non sono riusciti a risolvere la batteriuria UPEC e quindi non sarebbero stati utilizzati per il modello rUTI indotto da G. vaginalis. Al contrario, il cerchio verde indica topi che hanno risolto la batteriuria UPEC e proceduto alle fasi successive. (D) Tabella dei dati utilizzati per generare il grafico nel pannello C. Giallo, CFU rilevabile; verde, senza CFU. (E) Randomizzazione dei topi in gruppi di esposizione in base al punto temporale in cui i CFU UPEC non sono più stati rilevati nelle urine (“Day resolved”). I numeri del mouse nella colonna di sinistra del pannello D sono gli stessi numeri del mouse indicati nel pannello E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. G. vaginalis innesca UPEC rUTI. Titoli UPEC nelle urine a seguito di due esposizioni sequenziali del tratto urinario a PBS (cerchi) o G. vaginalis (Gvag; quadrati) somministrati a 12 ore (A) o 1 settimana (B) di distanza. Ogni simbolo rappresenta un singolo mouse. Viene tracciato il CFU/mL UPEC più alto rilevato da ciascun topo tra 1-3 d dopo la seconda esposizione. I topi senza batteriuria rilevabile sono tracciati al limite di rilevamento (linea tratteggiata). (C) Analisi citologica delle urine che mostra cellule UPEC (punte di freccia) e polimorfonucleate (PMN) (frecce). Barra della scala = 20 μm. (D) Titoli UPEC nei tessuti della vescica raccolti 3 d a seguito di due esposizioni sequenziali del tratto urinario somministrate a 1 settimana di distanza. Ogni simbolo rappresenta un mouse diverso e gli zeri sono tracciati al limite del rilevamento (linea tratteggiata). In A, B e D, le caselle sono al primo e al terzo quartile con la mediana marcata e baffi da min a max. Test U di Mann-Whitney * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4. Analisi SEM di vesciche fissate in situ. Le vesciche sono state raccolte dai topi 3 ore dopo due esposizioni (a 12 ore di distanza) a PBS (A) o G. vaginalis (C). Le linee tratteggiate illustrano una singola cellula epiteliale urinaria, che è più piccola nelle vesciche esposte a G. vaginalis perché le grandi cellule superficiali hanno esfoliato rivelando l’epitelio transizionale sottostante. (B) Vescica raccolta 6 ore dopo l’inoculazione iniziale con UPEC, durante la Fase 1 del modello, mostrando esfoliazione uroteliale e UPEC extracellulare. (D) Esempio di goccioline di grasso insolubili presenti sulla superficie della vescica. Le barre della scala sono 20 μm nelle immagini principali e 2 μm nell’inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il primo passo critico in questo modello per identificare i topi che non hanno eliminato la batteriuria UPEC durante la fase primaria di UTI. Questi topi devono essere rimossi dall’esperimento in quanto altrimenti confonderebbero i tassi di batteriuria UPEC dopo l’esposizione a G. vaginalis. Dopo l’inoculazione iniziale di UPEC, l’urina deve essere raccolta settimanalmente per monitorare la clearance batterica. Circa il 65-80% dei topi C57BL/6 eliminerà un’infezione da UTI89^kanR entro 4 settimane. Altri ceppi di topo inbred hanno diverse propensioni per la clearance UPEC^42,43 e la formazione del serbatoio e quindi potrebbero non essere adatti per questo modello. Il secondo punto critico è che studi empirici hanno determinato che due inoculazioni sequenziali di G. vaginalis (a 12 ore o 1 settimana di distanza) sono necessarie per innescare una significativa emergenza del serbatoio sopra l’emergenza spontanea di fondo che si verifica nei topi di controllo esposti solo a PBS. Altre durate di tempo tra le due esposizioni sequenziali non sono state testate, ma potrebbero produrre risultati simili. È importante notare che una riduzione dei titoli della vescica UPEC è stata osservata solo nel modello in cui le esposizioni a G. vaginalis sono state somministrate 1 settimana a parte³⁹. Mentre possono essere somministrate più di due esposizioni, l’evidenza empirica suggerisce che la cateterizzazione ripetuta da sola aumenta l’emergenza, il che può confondere l’interpretazione dei risultati o richiedere un numero maggiore di animali per distinguere le differenze tra gruppi di esposizione e controlli. Infine, il metodo di fissazione della vescica in situ ha diversi passaggi critici. È necessaria una certa abilità per garantire che il fissativo rimanga all’interno delle vesciche bloccate. Le vesciche sgonfiate saranno più difficili da visualizzare da SEM. È anche essenziale essere molto delicati quando si inocula il fissativo nella vescica, poiché raschiare l’urotelio con il catetere contenente fissativo può indurre l’esfoliazione uroteliale indipendentemente da ciò che viene innescato da G. vaginalis. Tutte le concentrazioni menzionate nel cocktail fissativo sono concentrazioni finali. Rapporti impropri di questi possono causare un fissaggio insufficiente e gonfiore o restringimento delle cellule. I fissativi devono essere riscaldati a temperature fisiologiche per evitare shock termici nelle cellule e nei tessuti. Il riscaldamento fornisce anche un leggero miglioramento del tasso di diffusione dei fissativi attraverso le membrane plasmatiche. Mentre la colorazione dell’osmio può spesso essere omessa per i campioni preparati per l’analisi SEM, è un passo essenziale in questo protocollo per stabilizzare i lipidi e prevenire la fessurazione delle membrane cellulari durante l’essiccazione del punto critico.

Questo protocollo può essere modificato per testare altri ceppi UPEC e / o G. vaginalis per la loro capacità di formare serbatoi e di innescare la loro comparsa, rispettivamente. Altri fattori sperimentali possono anche essere aggiunti, come l’esposizione ad altri batteri vaginali (ad esempio, Lactobacillus crispatus PVAS100) o G. vaginalis ucciso dal calore, nessuno dei quali dimostra patologia in questo modello³⁹. Quando si selezionano altri ceppi batterici da testare, è importante dimostrare una crescita costante in modo tale che una concentrazione standard di inoculo possa essere utilizzata in tutti gli esperimenti. La crescita di JCP8151B^SmR è stata ottimizzata in una camera anaerobica. Questo ceppo potrebbe probabilmente essere coltivato in un sistema GasPak anaerobico, ma ciò richiederebbe un’ottimizzazione per garantire una robusta crescita batterica. Infine, potrebbe essere possibile modificare la tempistica di determinati passaggi nel modello. Ad esempio, l’urina può essere raccolta in momenti precedenti durante la fase di formazione del serbatoio UPEC per monitorare le risposte CFU o dell’ospite. In questo modello non è stato osservato un effetto avverso della raccolta di campioni di urina nei primi timepoint (3, 6, 12 hpi) sulla progressione dell’infezione o sulla creazione di serbatoi. È stato segnalato che l’emergere di serbatoi UPEC si verifica dopo due dosi di JCP8151B^SmR somministrate 12 ore o 1 settimana, ma altri intervalli di tempo non sono ancora stati testati. Potrebbe anche essere possibile ridurre la durata complessiva del tempo per il modello riducendo la fase di formazione del serbatoio UPEC a 2 settimane (anziché 4 settimane), poiché molti dei topi eliminano la batteriuria a questo punto. Studi precedenti che esaminavano l’emergenza UPEC in seguito all’esposizione della vescica a esfolianti chimici utilizzavano una fase di formazione del serbatoio UPEC di 1 o 2 settimane^17,18. Tuttavia, la riduzione della quantità di tempo per la clearance della batteriuria UPEC può avvenire a costo di richiedere che più animali vengano abbattuti dall’esperimento. Infine, l’analisi SEM della vescica può essere eseguita in punti temporali aggiuntivi per osservare la durata dell’effetto di G. vaginalis sull’urotelio.

Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi, ci sono alcune considerazioni importanti in particolare rispetto all’analisi SEM della vescica. A seconda dello sfondo del topo utilizzato e della quantità di infiammazione presente, alcune vesciche si presenteranno con pareti molto sottili. Queste vesciche tendono ad arricciarsi di più durante l’essiccazione del punto critico e possono provocare una forma a conchiglia di cowrie. Se ciò si verifica, il metodo migliore è tagliare la vescica a forma di guscio a metà lungo l’interfaccia arricciata e poi una seconda volta per rimuovere la maggior parte del tessuto sporgente. Il taglio funziona meglio con una lama di rasoio a doppio taglio rivestita in PTFE. Il grasso in eccesso a volte può solubilizzarsi durante le fasi di colorazione dell’osmio. Ciò può causare goccioline di grasso insolubili indesiderate che potrebbero non lavarsi via durante le fasi di risciacquo e disidratazione e che possono depositarsi sulla superficie della vescica durante la successiva asciugatura. Queste goccioline possono apparire come piccole sfere o strutture simili a dischi sparse sul campione (Figura 4D). Questo può essere mitigato assicurando che il più possibile il tessuto adiposo venga rimosso da tutto il vescica. Il platino può essere sostituito dal rivestimento in iridio, ma gli spessori devono essere ridotti al minimo per ridurre il mascheramento dei dettagli strutturali fini. L’uso di uno stadio rotante durante il rivestimento è altamente raccomandato.

Una limitazione di questo modello è che richiede un gran numero di topi. Solo il 65-80% dei topi C57BL/6 eliminerà la batteriuria UPEC e sarà adatto per la successiva inoculazione di G. vaginalis o PBS (vedere Figura 2C). Per ottenere 10-12 topi per gruppo (inoculazione G. vaginalis vs PBS), ~ 30 topi devono essere inizialmente infettati da UPEC. Inoltre, sono probabilmente necessari più esperimenti per ottenere le repliche biologiche necessarie per rilevare la significatività statistica. Quando le esposizioni sono state somministrate a 1 settimana di distanza, l’emergenza UPEC si è verificata nel 14% dei topi esposti a PBS (Figura 3B). Pertanto, rilevare un aumento significativo dell’UPEC rUTI nei topi esposti a G. vaginalis rispetto ai controlli PBS (alimentato a 0,8; alfa = 0,05 [un lato]) richiede il test di un totale cumulativo di almeno 40 topi per ciascun gruppo di esposizione. Un’ulteriore considerazione è che questi esperimenti sono costosi e laboriosi. I topi devono essere monitorati settimanalmente per la clearance UPEC e il corso del tempo sperimentale è di 4-5 settimane a seconda che G. vaginalis venga somministrato due volte in un lasso di tempo di 12 ore o due volte 1 settimana di distanza. La SEM richiede molto lavoro e può essere costosa, a seconda della disponibilità del microscopio e dei costi di servizio. Preparare l’intera vescica per SEM fornisce materiale abbondante per l’analisi, ma lo svantaggio è che l’analisi di ciascuna vescica può richiedere molto tempo. Pertanto, è probabile che solo un numero limitato di vesciche possa essere analizzato da SEM rispetto al numero di animali più elevato utilizzato per i titoli di urina e tessuti. Inoltre, ottenere immagini di alta qualità delle superfici curve delle “tazze” della vescica richiede abilità a causa delle ombre che possono impedire la visibilità. Sebbene la SEM della vescica sia uno strumento utile per visualizzare l’esfoliazione uroteliale, questo metodo è in gran parte qualitativo. Poiché il campione è fissato in una forma rotonda e a causa dell’uso di glutaraldeide nel fissativo, lo screening per i batteri che esprimono fluorescentemente tramite microscopia ottica non è possibile. L’immunocolorazione e i coloranti chimici sono incompatibili con questo processo a causa dell’uso di glutaraldeide che reticola la maggior parte degli antigeni e dell’osmio e che maschera i siti dell’antigene e scurisce il tessuto. Detto questo, la tecnica SEM è utile per parametri che possono essere valutati quantitativamente senza l’uso di sonde aggiuntive, come la dimensione della cella^48,49.

Questo modello offre diversi vantaggi oltre ai metodi descritti in precedenza. Permette l’esame dei meccanismi di UPEC rUTI causati dall’emergenza dai serbatoi della vescica, al contrario della reintroduzione nella vescica da una fonte esterna. Altri modelli di rUTI dovuti all’emergenza dai serbatoi della vescica utilizzano agenti chimici (protamina solfato o chitosano) per causare l’esfoliazione uroteliale^17,18, che non sarebbe innesco di rUTI nelle donne. G. vaginalis è un batterio urogenitale prevalente che è stato rilevato nelle urine raccolte direttamente dalla vescica tramite cateterizzazione o aspirazione sovrapubica in alcune donne^23,26. Questo fatto, insieme alla nota associazione tra BV (in cui G. vaginalis cresce troppo nella vagina) e UTI, suggerisce che G. vaginalis è un trigger clinicamente plausibile di rUTI. Infine, il metodo di fissazione della vescica in situ preserva l’ultrastruttura della vescica e limita i danni, assicurando che gli strati della vescica non si separino l’uno dall’altro. I metodi precedenti per visualizzare l’urotelio tradizionalmente hanno l’utente che raccoglie, taglia in due, allunga e fissa la vescica su un vassoio di dissezione prima di immergere la vescica tesa in fissativo⁴⁸. Questo metodo si traduce in un campione molto piatto ma non garantisce uno stiramento uniforme o naturale del tessuto e può provocare aree che sono sopra e sotto tese (con conseguente tessuto altamente rugoso) e può causare la separazione dello strato della vescica. Inoltre, queste manipolazioni fisiche della vescica per allungare e bloccare il tessuto possono causare danni, tra cui l’esfoliazione uroteliale. Un altro metodo è quello di immergere le vesciche intatte in fissativo prima di incorporarle nella paraffina e acquisire sezioni sottili con un microtomo. Le sezioni sottili sono preziose per gli esperimenti di immunoistochimica per esaminare la localizzazione dei batteri e delle proteine dell’ospite, ma una sezione sottile non consente la visualizzazione della superficie uroteliale. Questo metodo SEM consente di esaminare contemporaneamente la superficie dell’intera vescica.

Come descritto, le applicazioni future di questo modello includono il test di altri ceppi UPEC per determinare se formano serbatoi intracellulari e il test di altri ceppi di G. vaginalis per valutare se provocano l’esfoliazione e l’emergenza UPEC per causare rUTI. Altri ceppi di topo oltre ai topi C57BL / 6 possono anche essere testati, anche se i topi con un’alta propensione allo sviluppo di cistite cronica (come i topi sullo sfondo C3H) non sono raccomandati, poiché troppi topi dovrebbero essere eliminati dall’esperimento. Un ulteriore vantaggio dei topi C57BL/6 è che molti ceppi genetici knockout sono disponibili in commercio. Tali ceppi offrono l’opportunità di interrogare i fattori ospiti coinvolti nella formazione e/o nell’emergenza del serbatoio.

Materials

30G x 1/2 needles	BD	305106	for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat	McKesson	487377	in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater	Leica		SEM sample processing
aluminum SEM stub	Ted Pella	16111	SEM sample processing
Calcium chloride	EMS	12340	in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab	Ted Pella	16084-1	SEM sample processing
Conductive silver paint	Ted Pella	16034	SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier	Leica		SEM sample processing
Cytofunnel metal clip	Simport	M964B	cytospun urinalysis
Ethanol	EMS	15050	SEM sample processing
Glucose	Sigma	G7528	for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde	EMS	16320	in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit	Fisher	23123869	cytospun urinalysis
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium	Ted Pella	91120	SEM sample processing
isofluorane			mouse anaesthesia
kanamycin	Gibco	11815024	add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar	BD	DF0445174	UPEC growth plates
Luria-Bertani broth	BD	DF0446173	UPEC growth media
Merlin FE-SEM	Zeiss		scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier	Millipore	IQ-7000	SEM sample processing
NaCl	Sigma	S3014	for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope	Olympus		cytospun urinalysis
osmium tetroxide	EMS	19170	SEM sample processing
paraformaldehyde	EMS	15710	in situ bladder fixation
polyethylene tubing	Intramedic	427401	for catheters
Proteose Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade	EMS	72000	cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300002	cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter	Simport	M965FWDV	cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel	Simport	M964-1D	cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated)	Thermo Scientific	5991055	cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate	EMS	12310	in situ bladder fixation
spectrophotometer	BioChrom	80-3000-45	measuring bacterial OD600
streptomycin	Gibco	11860038	add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe	BD	309659	for catheters
Yeast Extract	Fisher	DF0127-17-9	for NYCIII G. vaginalis growth media