소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절
Summary
본 연구에서, 발현은 특정 shRNA를 사용하여 PERK 경로의 두 가지 다운스트림 신호 전달 성분인 세포보호 칼시뉴린 및 프로-아폽토시스 CHOP의 녹다운됩니다. 반대로, 이들은 소포체 스트레스 유도 후 신경돌기 위축에 대한 일차 피질 뉴런의 감수성을 조절합니다.
Abstract
스트레스 조건으로 인한 소포체(ER) 내에 펼쳐진 단백질의 축적은 특수 센서의 활성화를 통해 풀린 단백질 반응(UPR)을 유발합니다. UPR은 먼저 항상성 회복을 시도합니다. 그러나 손상이 지속되면 신호 전달이 세포 사멸을 유도합니다.
지속적이고 해결되지 않은 ER 스트레스가 신경퇴행성 질환을 포함한 많은 병리학적 상태에 기여한다는 증거가 증가하고 있습니다. UPR은 세포 보호 과정과 세포 사멸 과정 사이를 전환하여 세포 운명을 제어하기 때문에 이 전환을 정의하는 사건과 조절과 관련된 요소를 이해하는 것이 필수적입니다.
최근에, 우리는 비정상적인 GM2 강글리오사이드 축적이 ERCa2+ 함량의 고갈을 유발하고, 이는 차례로 UPR 센서 중 하나인 PERK(PKR-like-ER 키나아제)를 활성화한다는 것을 입증했습니다. 또한, PERK 신호전달은 GM2 축적에 의해 유도된 신경돌기 위축 및 세포자멸사에 참여한다. 이와 관련하여 우리는 다운스트림 PERK 구성 요소의 발현을 분자적으로 조절하여 신경성 위축을 겪는 뉴런의 취약성을 변화시킬 수 있는 실험 시스템을 구축했습니다.
우리는 쥐 피질 신경 배양에서 칼시뉴린(세포 보호) 및 CHOP(pro-apoptotic) 발현의 녹다운을 수행했습니다. 세포를 렌티바이러스 전달 특이적 shRNA로 감염시킨 후 GM2를 상이한 시간에 처리하고, 항-MAP2(마이크로튜브 관련 단백질 2) 항체로 고정 및 면역염색하였다. 나중에, 세포 이미지는 형광 현미경을 사용하여 기록되었고, 전체 신경돌기 성장은 공개 도메인 이미지 처리 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 평가되었다. 이러한 PERK 신호 전달 성분의 발현 억제는 ER 스트레스에 의해 유발된 신경성 위축을 가속화하거나 지연시키는 것을 분명히 가능하게 했습니다.
이 접근법은 신경돌기 위축에 대한 뉴런의 취약성을 평가하기 위해 ER 스트레스의 세포 시스템 모델에서 사용될 수 있습니다.
Introduction
소포체(ER) 스트레스는 세포 소기관의 단백질 접힘 능력을 손상시키는 모든 섭동으로 정의됩니다. ER 내강 내에서 펼쳐진 단백질의 축적은 풀린 단백질 반응(UPR)이라고 하는 형질도입 캐스케이드 신호를 활성화합니다. 이 복잡한 신호 전달 경로는 PERK(단백질 키나아제 RNA[PKR]-유사 ER 키나아제), IRE1(이노시톨 요구 효소 1) 및 ATF6(활성화된 전사 인자 6)의 세 가지 스트레스 센서에 의해 조정됩니다. 모두 함께 항상성을 회복하려고 시도합니다. 그러나 스트레스가 지속되면 UPR은 결국 세포 사멸에 의한 세포 사멸을 유도합니다1.
ER 스트레스 시 ER 막횡단 단백질인 PERK는 진핵 개시 인자-2 알파(eIF2α)의 인산화를 유도하여 전체 단백질 합성을 감소시켜 ER2의 단백질 부하를 감소시킵니다. 우리는 이종이량체 Ca2+ 포스파타제인 칼시뉴린 A/B(CNA/B)가 PERK의 세포질 도메인에 직접 결합하여 자가 인산화를 증가시키고 단백질 번역 및 세포 생존율의 억제를 크게 향상시킨다는 것을 입증했습니다 3,4. 흥미롭게도 CNA/B는 포유류의 뇌에 풍부하여 CN의 서브유닛 A의 두 가지 동형인 α와 β를 구별합니다.
지속적인 ER 스트레스 하에서 PERK 신호 전달 경로는 활성화된 상태로 유지되는 유일한 UPR 분기이며, 따라서 생존 촉진 반응과 세포자멸사 반응을 모두 매개합니다. 만성 단계에서 한 가지 주요 다운스트림 사건은 전사 인자인 CHOP(CCAAT/인핸서 결합 단백질 상동 단백질)5의 유도입니다. 만성 ER 스트레스는 또한 신경퇴행성 질환을 포함한 광범위한 병리학적 장애의 일반적인 원인으로 점점 더 인식되고 있다6. UPR이 세포 사멸 대신 세포 보호 신호 전달을 촉진할 수 있는 방법을 이해하는 것이 중요하다 7. 그러나 현재로서는 이러한 두 UPR 단계 간의 전환을 제어하는 정확한 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
최근에 우리는 배양된 뉴런에서 강글리오사이드 GM2가 ER 막에 축적되어 내강 칼슘 고갈을 유도한다는 것을 발견했습니다. 이것은 차례로 신경돌기 위축과 세포자멸사를 매개하는 PERK 신호전달을 활성화시킨다 8. 이 연구에서 배양된 뉴런의 GM2 축적은 ER 스트레스 유발 신경돌기 위축의 세포 시스템 모델로 사용됩니다. 특히, CN-Aα 및 CHOP의 두 가지 PERK 인자 발현이 조작되어 초기/보호 이벤트와 만성/세포자멸사 단계 사이의 전환을 전환합니다. 이를 달성하기 위해 각 유전자는 침묵합니다. 따라서, 일차 피질 뉴런 배양은 렌티바이러스 전달 특이적 shRNA에 감염된다. 웨스턴 블롯 분석은 스크램블된 shRNA를 운반하는 렌티바이러스에 감염된 대조군 세포와 비교하여 CN-Aα 및 CHOP 발현 수준의 현저한 감소를 보여줍니다. 이 처리 후, 뉴런은 항미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 항체9로 고정되고 면역염색된 외인성 GM2의 상이한 배양 시간을 받습니다. 이미지는 epifluorescence 현미경으로 얻을 수 있습니다. 총 신경돌기 성장은 총 세포 수를 기준으로 평가됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 신경 세포 모델에서 생존에서 세포자멸사 UPR 단계로의 전환의 분자 조절을 가능하게 하는 실험 시스템을 설명합니다.
신경돌기 위축의 적절한 분석을 위해서는 수많은 길고 고도로 분지된 과정을 가진 1차 뉴런 배양을 얻는 것이 필수적입니다 9,11. 이것은 뉴런 프로세스 확장의 검사를 용이하게 하여 치료 간의 명확한 차이?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이미징에 귀중한 도움을 주신 Gonzalo Quasollo 박사와 세포 배양 기술 지원을 해주신 Andrea Pellegrini 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 미국 국립 보건원(#RO1AG058778-01A1, UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra 간의 하위 계약 번호 165148/165147) 및 아르헨티나 국립 과학 기술 진흥청(ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
Referências
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
