JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Química

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Published: June 15, 2021
doi:
10.3791/61983
, , ,
1Department of Chemistry,University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program,University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences,Chulalongkorn University

Summary

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Abstract

Caracterizar a estrutura de alta ordem de uma proteína é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa (MS) emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar a estrutura de uma proteína por MS, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica as informações estruturais de uma proteína em sua massa. Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis de solvente. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de diethylpirocarbonato (DEPC) como um reagente de rotulagem covalente juntamente com a detecção de MS. O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso junto com a MS para obter informações estruturais para pequenas proteínas de domínio único, como β2-microglobulina, para grandes proteínas multi-domínio, como anticorpos monoclonais.

Introduction

Proteínas são biomoléculas essenciais em praticamente todos os processos fisiológicos. A variedade de funções que as proteínas realizam são possíveis devido às estruturas que adotam e às interações que têm com outras biomoléculas. Para entender a função proteica em um nível mais profundo, ferramentas bioquímicas e biofísicas são necessárias para elucidar essas importantes características e interações estruturais. Tradicionalmente, a cristalografia de raios-X, a microscopia eletrônica criogênica e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) forneceram o detalhe desejado do nível atômico para revelar a estrutura proteica. No entanto, inúmeros sistemas proteicos não podem ser interrogados por essas técnicas devido ao mau comportamento de cristalização, disponibilidade limitada de proteínas, heterogeneidade excessiva da amostra ou limitações de peso molecular. Consequentemente, surgiram novos métodos de análise que superam essas limitações. Entre as técnicas emergentes que podem fornecer informações estruturais proteicas está a espectrometria de massa.

A espectrometria de massa (MS) mede a relação massa-carga (m/z) de uma molécula, de modo que informações estruturais de alta ordem proteica devem ser obtidas codificando as informações estruturais desejadas na massa da proteína. Várias abordagens para codificar essas informações foram desenvolvidas, incluindo troca de deutério de hidrogênio (HDX)1,2,3,4, crosslinking químico (XL)5,6, e rotulagem covalente (CL)7,8,9,10. Em HDX, os hidrogênios de amido de espinha dorsal são trocados por deutérios ligeiramente mais massivos a taxas que dependem da acessibilidade solvente e da extensão de ligação H. A extensão do HDX pode ser localizada digerindo rapidamente a proteína em fragmentos de peptídeos antes de separar e medir esses fragmentos pelo espectrômetro de massa ou dissolvendo a proteína em um experimento de cima para baixo. Determinar a taxa de câmbio fornece mais informações sobre a dinâmica das proteínas. A HDX provou ser uma ferramenta valiosa para caracterizar a estrutura proteica, apesar dos desafios associados à troca traseira e da necessidade de equipamentos especializados para maximizar a reprodutibilidade. No XL-MS, as proteínas são reagidas com reagentes bifuncionais que ligam covalentemente cadeias laterais de resíduos dentro de uma determinada proteína ou entre duas proteínas. Ao fazer isso, o XL-MS pode fornecer restrições de distância que podem ser usadas para caracterizar a estrutura proteica. As regiões da proteína que estão cruzadas podem ser identificadas pela digestão proteolítica seguida de cromatografia líquida (LC)-MS. Embora o XL-MS seja uma ferramenta versátil que tem sido usada para estudar uma variedade de complexos proteicos, incluindo células internas, a identificação dos produtos XL é desafiadora e requer software especializado.

O CL-MS emergiu recentemente como uma ferramenta complementar e às vezes alternativa baseada em MS para estudar a estrutura e as interações proteicas. Em CL-MS, um complexo proteico ou proteico é covalentemente modificado com um reagente monofuncional que pode reagir com cadeias laterais expostas a solventes(Figura 1). Comparando as extensões de modificação de um complexo proteico ou proteico em diferentes condições, mudanças de conformação, locais de ligação e interfaces proteína-proteína podem ser reveladas. Após a reação cl, informações específicas do local, muitas vezes no nível único de aminoácidos, podem ser obtidas usando fluxos de trabalho típicos de proteômica de baixo para cima em que as proteínas são digeridas proteolíticos, fragmentos de peptídeos são separados por LC e locais modificados são identificados usando ms tandem (MS/MS). A rica história da química bioconjugada disponibilizou numerosos reagentes para experimentos cl-ms. Os reagentes CL se enquadram em duas categorias gerais: (i) específicas e (ii) não específicas. Reagentes específicos reagem com um único grupo funcional (por exemplo, aminas livres)8,10 e são fáceis de implementar, mas tendem a fornecer informações estruturais limitadas. Reagentes não específicos reagem com uma ampla gama de cadeias laterais, mas muitas vezes requerem equipamentos especializados, como lasers ou fontes síncrotrons para produzir essas espécies altamente reativas. Os radicais hidroxil são os reagentes não específicos mais utilizados, tendo sido aplicados em pegada radical hidroxil (HRF)7,11,12,13 experimentos para estudar uma ampla gama de proteínas e complexos proteicos sob uma variedade de condições.

Nosso grupo de pesquisa utilizou com sucesso outro reagente relativamente não específico chamado dietilpiroto (DEPC) para estudar estrutura proteica e interações no contexto dos experimentos cl-ms14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. O DEPC oferece a simplicidade de reagentes de rotulagem específicos (ou seja, nenhum equipamento especializado é necessário para realizar as reações), ao mesmo tempo em que reage com até 30% dos aminoácidos na proteína média. Como um reagente altamente eletrofílico, o DEPC é capaz de reagir com os resíduos n-terminus e as cadeias laterais nucleofílicas de cisteína, histidina, lise, tyrosina, serina e resíduos de threonina. Normalmente, um único produto dessas reações é gerado, resultando em um aumento em massa de 72,02 Da. Este único tipo de produto contrasta com os até 55 produtos diferentes que podem ser produzidos quando as proteínas reagem com radicais hidroxil7. Tal química simples facilita a identificação de locais rotulados.

Aqui, fornecemos protocolos para o uso do CL-MS baseado em DEPC para estudar estrutura e interações proteicas. Detalhes associados à preparação de reagentes, reações de proteínas DEPC, condições de digestão proteica, parâmetros LC-MS e MS/MS e análise de dados são descritos. Também demonstramos a utilidade da rotulagem DEPC, fornecendo exemplos de interações proteína-metal, proteína-ligante e proteína-proteína, bem como proteínas submetidas a mudanças estruturais após o aquecimento.

Protocol

1. Preparação de proteínas e reagentes NOTA: Este protocolo inclui um fluxo de trabalho de exemplo para rotular uma proteína com DEPC. Algumas condições e concentrações de reagentes listadas podem variar de acordo com a proteína escolhida. Prepare todas as soluções de reagente em tubos de microcentrifus de 1,5 mL. Prepare uma solução proteica de concentração desejada, geralmente na faixa de dezenas de μM, em um tampão de ácido propanesulfônico de 10 mM 3-…

Representative Results

Identificação de locais de modificação do DEPC e percentagens de modificaçãoA adição em massa devido à rotulagem covalente pode ser medida nos (a) níveis de proteína intacta e (b) peptídeo8,9. No nível intacto, uma distribuição de espécies proteicas com diferentes números de rótulos pode ser obtida a partir de análise direta ou LC-MS de amostras de proteínas rotuladas. Para obter informações estruturais de maior resolução (ou …

Discussion

Passos críticos
Vários pontos relativos ao design experimental devem ser considerados para garantir resultados confiáveis de rotulagem. Primeiro, para maximizar a rotulagem de proteínas, é necessário evitar buffers com grupos fortemente nucleofílicos (por exemplo, Tris) porque eles podem reagir com o DEPC e diminuir a extensão da rotulagem. Também é concebível que tais tampões possam reagir com resíduos rotulados, causando a remoção do rótulo e, portanto, a perda de informações estruturais. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Grant R01 GM075092. O espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Fusion usado para adquirir alguns dos dados aqui descritos foi adquirido com recursos do Instituto Nacional de Saúde s10OD010645.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Bioquímica. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Bioquímica. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Bioquímica. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Bioquímica. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Bioquímica. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O’Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Bioquímica. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Bioquímica. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO – A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

Keywords: Covalent LabelingDiethylpyrocarbonateDEPCMass SpectrometryProtein StructureStructural CharacterizationBuffer ExchangeImidazole
check_url/pt/61983?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image