Højindhold Screening Differentiering og modning Analyse af Føtal og Voksen Neural Stamcelle-afledt Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

Summary

Vi beskriver produktionen af blandede kulturer af astrocytter og oligodendrocyt prækursorceller afledt af føtale eller voksne neurale stamceller differentiere i modne oligodendrocytter, og in vitro modellering af skadelige stimuli. Koblingen med en cellebaseret screeningsteknik med højt indhold opbygger et pålideligt og robust lægemiddelscreeningssystem.

Abstract

Den største hindring for udviklingen af lægemiddelscreeningsteknikker til vurdering af effektiviteten af terapeutiske strategier for komplekse sygdomme er at finde en balance mellem in vitro-forenkling og genskabelse af det komplekse in vivo-miljø sammen med det hovedformål, der deles af alle screeningsstrategier, om at opnå robuste og pålidelige data, der er meget prædiktive for in vivo-oversættelse.

Inden for demyelinerende sygdomme er de fleste lægemiddelscreeningsstrategier baseret på udødeliggjorte cellelinjer eller rene kulturer af isolerede primære oligodendrocytprækursorerceller (OPCs) fra nyfødte dyr, hvilket fører til stærke fordomme på grund af manglen på aldersrelaterede forskelle og af enhver reel patologisk tilstand eller kompleksitet.

Her viser vi opsætningen af et in vitro-system, der har til formål at modellere den fysiologiske differentiering / modning af neurale stamcelle (NSC)-afledte OPCs, let manipuleret til at efterligne patologiske tilstande, der er typiske for demyelinerende sygdomme. Desuden omfatter metoden isolation fra foster- og voksenhjerner, hvilket giver et system, der dynamisk adskiller sig fra OPCs til modne oligodendrocytter (OLs) i en spontan co-kultur, som også omfatter astrocytter. Denne model fysiologisk ligner skjoldbruskkirtlen hormon-medieret myelination og myelin reparation proces, så tilføjelsen af patologiske interferents som model sygdomsmekanismer. Vi viser, hvordan man efterligner de to hovedkomponenter i demyelinerende sygdomme (dvs. hypoxi / iskæmi og betændelse), genskaber deres virkning på udviklingsmæssig myelination og voksen myelin reparation og tager alle systemets cellekomponenter i betragtning hele vejen igennem, samtidig med at der fokuseres på at differentiere OPCs.

Denne spontane blandede model kombineret med cellebaserede screeningsteknologier med højt indhold gør det muligt at udvikle et robust og pålideligt lægemiddelscreeningssystem for terapeutiske strategier, der har til formål at bekæmpe de patologiske processer, der er involveret i demyelination, og at fremkalde remyelination.

Introduction

I centralnervesystemet (CNS), myelin danner celler (oligodendrocytter, OPLs) og deres prækursorer (oligodendrocyt prækursor celler, OPCs) er ansvarlige for udviklingsmæssige myelination, en proces, der opstår i løbet af perioden og efter fødslen perioder, og for myelin omsætning og reparation (remyelination) i voksenalderen¹. Disse celler er højt specialiserede, interagerer anatomisk og funktionelt med alle de andre glial og neuronale komponenter, hvilket gør dem til en grundlæggende del af CNS struktur og funktion.

Demyelinating begivenheder er involveret i forskellige CNS skader og sygdomme², og primært handle på OPCs og OPLs i form af multifaktorielle mekanismer, både under udvikling og voksenalderen. De udifferentierede prækursorer er drevet af differentierende faktorer, hovedsagelig skjoldbruskkirtlen hormon (TH), i en synkroniseret proces^3, som fører OPC til at genkende og reagere på specifikke stimuli, som fremkalder spredning, migration til ikke-myelineret axon, og differentiering i modne OPLs, som igen udvikle myelin kappe⁴. Alle disse processer er fint kontrolleret og forekommer i et komplekst miljø.

På grund af myelinationskompleksitets-, remyelination- og demyelinationshændelser er der et stort behov for en forenklet og pålidelig in vitro-metode til at studere de underliggende mekanismer og udvikle nye terapeutiske strategier med fokus på den vigtigste cellulære aktør: OPC⁵.

For at et in vitro-system skal være pålideligt, er det nødvendigt at tage hensyn til en række faktorer: kompleksiteten af det cellulære miljø, aldersrelaterede celle-iboende forskelle, fysiologisk TH-medieret differentiering, patologiske mekanismer og dataenes robusthed⁶. Faktisk er det uopfyldte behov på området en model, der efterligner kompleksiteten af in vivo-tilstanden, som ikke med succes opnås ved brug af isolerede rene OPC-kulturer. Derudover involverer de to hovedkomponenter i demyelinerende hændelser, inflammation og hypoxi/iskæmi (HI), direkte andre cellekomponenter, der indirekte kan påvirke OPCs fysiologisk differentiering og modning, et aspekt, der ikke kan undersøges i oversimplificerede in vitro-modeller.

Med udgangspunkt i et meget prædiktivt kultursystem er den efterfølgende og mere generelle udfordring produktionen af robuste og pålidelige data. I denne sammenhæng er cellebaseret screening med højt indhold (HCS) den mest egnede teknik⁷, da vores mål for det første er at analysere hele kulturen i en automatisk arbejdsgang, undgå bias ved at vælge repræsentative felter og for det andet at opnå den automatiske og samtidige generering af billedbehandlingsbaserede data med højt indhold⁸.

I betragtning af at det største behov er at opnå den bedste balance mellem in vitro-forenkling og in vivo-efterligne kompleksitet, præsenterer vi her en meget reproducerbar metode til at opnå OPCs afledt af neurale stamceller (NSC’er), der er isoleret fra fosterhjernen og den voksne subtritrikulær zone (SVZ). Denne in vitro-model omfatter hele OPC-differentieringsprocessen, fra multipotent NSC til moden / myelinerende OL, på en fysiologisk TH-afhængig måde. Den resulterende kultur er et dynamisk differentierende / maturerende system, som resulterer i en spontan co-kultur, der hovedsagelig består af at differentiere OPCs og astrocytter, med en lav procentdel af neuroner. Denne primære kultur efterligner bedre det komplekse in vivo-miljø, mens dets stamcelleafledning gør det muligt at udføre enkle manipulationer for at opnå den ønskede cellelinjeberigelse.

I modsætning til andre lægemiddelscreeningsstrategier ved hjælp af cellelinjer eller rene kulturer af primære OPCs tillader den metode, der er beskrevet her, at undersøge effekten af patologiske interferents eller terapeutiske molekyler i et komplekst miljø uden at miste fokus på den ønskede celletype. Hcs workflow beskrevet tillader en analyse af celle levedygtighed og afstamning specifikation, samt afstamning-specifikke celledød og morfologiske parametre.

Protocol

Alle de koedprotokoller , der er beskrevet heri , blev gennemført i overensstemmelse med Det Europæiske Råds direktiv (86/609/EØF) og i overensstemmelse med retningslinjerne i NIH’s vejledning om pleje og anvendelse af laboratoriedyr. 1. Løsninger og reagenser Forbered standardmedium: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% P/S); 1x B27; 1x N-2. Forbered neurosfæremedium: tilsæt 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL EGF til standard…

Representative Results

Den første fase af kulturen kan variere i varighed, afhængigt af såningstætheden og om kuglerne er af foster- eller voksen oprindelse. Desuden viser oligosfærer en reduceret fordoblet befolkning i forhold til neurosfærer (Figur 1B). Desuden er sfæreproduktionen fra voksenvæv langsommere, og det kan tage 2-3 uger at generere oligosfærer sammenlignet med foster, der kan tage 1-2 uger, afhængigt af såningstætheden. Når sået, hele differentiering fase af…

Discussion

Den komplekse karakter af myelination / remyelination processer og afmyelinating begivenheder gør udviklingen af prædiktive in vitro-systemer yderst udfordrende. De mest udbredte in vitro-lægemiddelscreeningssystemer er for det meste menneskelige cellelinjer eller primære rene OL-kulturer med stigende brug af mere komplekse samkulturer eller organotypicsystemer¹⁵. Selv om sådanne systemer er kombineret med teknologier med højt indhold, er rene OL-kulturer stadig den foretrukne metode, når d…

Materials

96-well plates – untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426