Direkte omprogrammering af humane fibroblaster til myoblaster for at undersøge behandlingsformer for neuromuskulære lidelser
Summary
Denne protokol beskriver konverteringen af hudfibroblaster til myoblaster og deres differentiering til myorør. Cellelinjerne er afledt af patienter med neuromuskulære lidelser og kan bruges til at undersøge patologiske mekanismer og til at teste terapeutiske strategier.
Abstract
Undersøgelser af både patofysiologi og terapeutiske mål i muskeldystrofier er blevet hæmmet af den begrænsede proliferative kapacitet af menneskelige myoblaster. Flere musemodeller er blevet skabt, men de repræsenterer enten ikke rigtig sygdommens menneskelige fysiopatologi eller er ikke repræsentative for det brede spektrum af mutationer, der findes hos mennesker. Udødeliggørelsen af menneskets primære myoblaster er et alternativ til denne begrænsning; Det er dog stadig afhængig af muskelbiopsier, som er invasive og ikke let tilgængelige. I modsætning hertil er hudens biopsier lettere at opnå og mindre invasive for patienterne. Fibroblaster stammer fra hudens biopsier kan udødeliggøres og transdifferentieres i myoblaster, hvilket giver en kilde til celler med fremragende myogen potentiale. Her beskriver vi en hurtig og direkte omprogrammering metode fibroblast i en myogen afstamning. Fibroblaster transduceres med to lentivirus: hTERT at udødeliggøre den primære kultur og en tet-indukbel MYOD, som ved tilsætning af doxycyclin, fremkalder konvertering af fibroblaster i myoblaster og derefter modne myorør, som udtrykker sene differentiering markører. Denne hurtige transdifferentieringsprotokol repræsenterer et effektivt værktøj til at undersøge patologiske mekanismer og til at undersøge innovative genbaserede eller farmakologiske bioterapier for neuromuskulære lidelser.
Introduction
Cellulære modeller opnået direkte fra humane væv er nyttige til at modellere mange menneskelige genetiske sygdomme, med den fordel at have den oprindelige genomiske kontekst og i mange tilfælde reproducere de samme molekylære og cellulære kendetegn observeret hos patienterne. Inden for neuromuskulære lidelser har muskelbiopsier været en stor kilde til menneskelige myoblaster og har hjulpet med at belyse patologiske mekanismer. Derudover er de et vigtigt redskab til in vivo-test af lægemidler og genterapier. På den ene side er afledningen af myoblaster fra muskelfragmenter relativt let. På den anden side er kulturen og vedligeholdelsen af primære myoblaster udfordrende på grund af deres begrænsede spredningshastighed og repliktive senescens in vitro1. Et alternativ til disse begrænsninger er at udødeliggøre myoblaster med indsættelsen af den menneskelige telomerase (hTERT) og / eller cyclin-afhængige kinase 4 (CDK4) gener2,3, med bevarelse af skeletmuskulatur funktioner4. Ikke desto mindre er obtention af primære myoblaster stadig afhængig af muskelbiopsi, en kirurgisk procedure med ulemper for patienterne, som i mange tilfælde har deres muskler i avanceret degeneration. Således er musklen af disse patienter består af en betydelig andel af fibrotiske og / eller fedtvæv og giver færre muskelceller, der kræver rensning af cellerne tidligere til udødeliggørelse.
I modsætning til muskelbiopsier er hudbiopsier mere tilgængelige og er mindre skadelige for patienterne. Primære fibroblaster kan udledes af hudfragmenter in vitro. Selvom fibroblaster ikke primært påvirkes af mutationer, der forårsager neuromuskulære lidelser, kan de transdifferentieres til myoblaster. Dette kan opnås ved indsættelse af Myod-genet, en myogen regulatorisk transskriptionsfaktor5. I dette manuskript beskriver vi protokollen for at opnå transdifferentiated myoblaster, fra etablering af fibroblaster kulturer til obtention af differentierede myorør (et repræsentativt resumé af metoden er afbildet i figur 1).
Præklinisk testning af terapeutiske strategier er afhængig af cellulære modeller og dyremodeller, der bærer mutationer svarende til de mutationer, der findes hos mennesker. Selv om udviklingen af dyremodeller er blevet mere gennemførlig med udviklingen af genredigeringsteknologier som CRISPR/Cas96, er det stadig udfordrende og dyrt. Således er patient-afledte cellelinjer en tilgængelig mulighed for at have modeller, der dækker det store spektrum af mutationer af sygdom som Duchenne muskeldystrofi (DMD). Obtention og oprettelse af cellemodeller er afgørende for udviklingen af personlige terapier til sådanne patologier.
Blandt personlige terapier, der er blevet undersøgt, exon springe strategier er en af de lovende dem for forskellige muskeldystrofier7,8. Denne strategi består i at producere et kortere, men funktionelt protein. Dette gøres ved at skjule exon definition til splejsning, derfor udelukke muterede exon fra den endelige messenger. Dette er en meget lovende teknologi, der er blevet godkendt af FDA for DMD. Således beskriver vi også i denne protokol metoder til at transfektere myoblaster med to forskellige exon springe relaterede teknologier over: antisense oligonukleotider (AON) og U7snRNA-adeno-associeret virus (AAV). AON transfection er et godt værktøj til den indledende screening af flere sekvenser designet til at fremme exon springe9. AON’ernes aktivitet er imidlertid forbigående. For at opnå et vedvarende udtryk for antisensesekvenser undersøgte vi også små nukleare RNA’er (snRNA’ er) kombineret med AAV, hvilket gjorde det muligt at lokalisere og inkludere nukleart i splejsningsmaskineriet10. U7 er en snRNA involveret i behandlingen af histone mRNA, der kan manipuleres til at binde proteiner, der vil omdirigere det til splejsning og levere antisense sekvenser11. Brugen af modificerede U7 snRNA’er i kombination med AAV-vektorer overvinder begrænsninger af AON’er , hvilket resulterer i et fortsat udtryk for AON’erne og bedre transduktion af væv af interesse12. Vi bruger celler afledt af DMD patienter til denne protokol til at illustrere exon-spring strategi.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at opnå FM-cellelinjer af god kvalitet er nogle trin kritiske. Jo før hudens biopsi behandles, jo større er chancerne for at opnå sunde fibroblaster. Passagen antallet af fibroblaster kulturer er også vigtigt. Primære celler har begrænset proliferativ kapacitet, og efter mange passager kommer de ind i replikativ senescens. Således er det bedre at have en bestand af fibroblaster ved et lavt passagenummer og omdanne celler ved den tidligste passage som muligt.
Et andet vigtigt skrid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Vincent Mouly for at dele sin viden i fortiden om modellen. Dette arbejde er blevet støttet af US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., og R.B.W.)), US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N. og N.W.). NW har modtaget stipendium støtte fra Ohio State University / Landsdækkende Children’s Hospital Muscle Group og Philippe Foundation. Dette arbejde blev også støttet af interne diskretionære midler og en del af exon 2 spring arbejde er blevet støttet også af CureDuchenne (K.M.F.) og Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 og IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
Referências
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Biologia do Desenvolvimento. 265 (2), 294-301 (2004).
