मॉड्यूलर गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके मल्टी-जीन निर्माण की रैपिड असेंबली
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य गोल्डन गेट क्लोनिंग के आधार पर मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रणाली का उपयोग करके बहु-जीन निर्माण कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करना है। यह हमारे अनुभवों के आधार पर इष्टतम असेंबली सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों पर सिफारिशें भी देता है।
Abstract
गोल्डन गेट क्लोनिंग विधि किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित व्यवस्था में कई जीन की तेजी से विधानसभा सक्षम बनाता है । यह प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है जो उनकी मान्यता साइटों के बाहर काटते हैं और एक छोटी अधिकता बनाते हैं। यह मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली एक पदानुक्रमित कार्यप्रवाह का उपयोग करती है जिसमें विभिन्न डीएनए भागों, जैसे प्रमोटर, कोडिंग दृश्य (सीडीएस), और टर्मिनेटर, पहले एक प्रवेश वेक्टर में क्लोन किए जाते हैं। कई प्रवेश वैक्टर तो प्रतिलेखन इकाइयों में इकट्ठा। कई ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां फिर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कनेक्ट होती हैं। गोल्डन गेट क्लोनिंग रणनीति जबरदस्त लाभ की है क्योंकि यह एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति देता है । पदानुक्रमित कार्यप्रवाह आम तौर पर प्रवेश वैक्टर से परे अनुक्रमण की कोई आवश्यकता नहीं के साथ बहु-जीन निर्माण की एक बड़ी विविधता की फेसियल क्लोनिंग को सक्षम बनाता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्रॉपआउट का उपयोग आसान दृश्य स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। यह काम खमीर मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) किट का उपयोग कर बहु जीन प्लाज्मिड कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । हम बहु-जीन प्लाज्मिड असेंबली के इष्टतम और उप-इष्टतम परिणाम दिखाते हैं और कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। यह क्लोनिंग रणनीति खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग और अन्य स्थितियों के लिए अत्यधिक लागू होती है जिसमें बहु-जीन प्लाज्मिड क्लोनिंग की आवश्यकता होती है।
Introduction
सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य दवा, कृषि और रासायनिक उद्योगों के लिए उपयोगी नई कार्यक्षमताओं के साथ जैविक प्रणालियों को इंजीनियर करना है। एक उच्च थ्रूपुट तरीके से डीएनए के टुकड़ों की बड़ी संख्या कोडांतरण सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक मूलभूत प्रौद्योगिकी है । इस तरह की जटिल प्रक्रिया जटिलता को कम करने के साथ कई स्तरों में टूट सकती है, बुनियादी इंजीनियरिंग विज्ञान1,2से उधार ली गई अवधारणा। सिंथेटिक जीव विज्ञान में, डीएनए टुकड़े आमतौर पर कार्यक्षमता के आधार पर पदानुक्रम से इकट्ठा होते हैं: (i) भाग स्तर: “भाग” एक विशिष्ट कार्य के साथ डीएनए टुकड़ों को संदर्भित करता है, जैसे कि प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम, एक टर्मिनेटर, प्रतिकृति की उत्पत्ति; (ii) ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों (टीयू) स्तर: एक टीयू में एक प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम और एक एकल जीन को पार करने में सक्षम टर्मिनेटर होता है; (iii) बहु-जीन स्तर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कई टीयू होते हैं जिनमें अक्सर एक संपूर्ण मेटाबोलिक मार्ग शामिल होता है । बायोब्रिक समुदाय द्वारा बीड़ा उठाया गया यह पदानुक्रमित असेंबली सिंथेटिक जीव विज्ञान3में डीएनए के बड़े सेटों की असेंबली के लिए मूलभूत अवधारणा है।
पिछले4, 5,6,7दशक में गोल्डन गेट क्लोनिंग तकनीक ने पदानुक्रमित डीएनए असेंबली2को काफी सुविधा प्रदान की है . गिब्सन क्लोनिंग8,लिगेशन-इंडिपेंडेंट क्लोनिंग (एससीआईएल)9,यूरासिल एक्सिशन-बेस्ड क्लोनिंग (यूजर)10,लिगास साइक्लिंग रिएक्शन (एलसीआर) 11 और वीवो रिकॉम्बिनेशन (डीएनए असेंबलर)12,13जैसे कई अन्य मल्टी-पार्ट क्लोनिंग तरीके भी अब तक विकसित किए गए हैं । लेकिन गोल्डन गेट क्लोनिंग एक आदर्श डीएनए विधानसभा विधि है क्योंकि यह जीन विशिष्ट दृश्यों से स्वतंत्र है, एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति । गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का लाभ लेता है जो मान्यता साइट2के बाहर कंपित ओवरहैंग बनाने के लिए एक गैर-पैलिंड्रोमिक अनुक्रम को पहचानते हैं। एक ligase तो एक बहु भाग विधानसभा प्राप्त करने के लिए annealed डीएनए टुकड़े में मिलती है । मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली के लिए इस क्लोनिंग रणनीति लागू करने के लिए 90% से अधिक परिवर्तनकर्ताओं सही ढंग से इकट्ठे निर्माण4युक्त जांच के साथ 10 डीएनए टुकड़े करने के लिए इकट्ठा सक्षम है।
MoClo प्रणाली जबरदस्त लाभ है कि सिंथेटिक जीव विज्ञान के डिजाइन निर्माण परीक्षण चक्र में तेजी आई है प्रदान करता है । सबसे पहले, इंटरचेंजेबल हिस्से तेजी से मापदंडों की एक बड़ी जगह का परीक्षण करने के लिए संयोजन क्लोनिंग को सक्षम करते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाबोलिक मार्ग का अनुकूलन आमतौर पर मार्ग प्रवाह को संतुलित करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए कई प्रमोटरों के माध्यम से साइकिल चालन की आवश्यकता होती है। MoClo प्रणाली आसानी से इस तरह की मांग क्लोनिंग कार्यों को संभाल कर सकते हैं । दूसरे, एक भाग प्लाज्मिड अनुक्रम की जरूरत है, लेकिन आम तौर पर नहीं टीयू या बहु जीन प्लाज्मिड । ज्यादातर मामलों में, कॉलोनी पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग या प्रतिबंध पाचन टीयू और बहु-जीन प्लाज्मिड स्तर पर सत्यापन के लिए पर्याप्त है। इसका कारण यह है कि भाग प्लाज्मिड क्लोनिंग पीसीआर की आवश्यकता होती है, जो अक्सर म्यूटेशन का परिचय देता है। तीसरा, MoClo प्रणाली बहु जीन जटिल मेटाबोलिक रास्ते के निर्माण के लिए आदर्श है । अंत में, सार्वभौमिक ओवरहैंग के कारण, भाग प्लाज्मिड को पूरे बायोइंजीनियरिंग समुदाय के साथ पुन: इस् तेमित और साझा किया जा सकता है। वर्तमान में, 14 ,15, 5,16,17,कवक 6,18, 19,20,21,22,बैक्टीरिया 7 ,23,24, 25,26,27,और जानवरों केलिए 28,29पौधों के लिए MoClo किट उपलब्ध हैं। हाल ही में30को एक मल्टी-किंगडम मोक्लो प्लेटफॉर्म भी पेश किया गया है ।
सैकरोमाइसेस सेरेविसिया केलिए, ली एट अल6 ने एक बहुमुखी मोक्लो टूलकिट विकसित किया है, जो खमीर सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है। यह किट एक सुविधाजनक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में आती है और अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रमोटरों, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, टर्मिनेटर, पेप्टाइड टैग, चयन मार्कर, प्रतिकृति की उत्पत्ति और जीनोम संपादन उपकरणों के विविध संग्रह के साथ आठ प्रकार के विनिमेय डीएनए भागों को परिभाषित करती है। यह टूलकिट एक बहु-जीन प्लाज्मिड में पांच ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों की असेंबली की अनुमति देता है। ये विशेषताएं खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग के लिए मूल्यवान हैं, जिसमें लक्षित रसायनों का उत्पादन करने के लिए आंशिक या पूरे रास्ते अधिक व्यक्त किए जाते हैं। इस किट का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने खमीर में जेरनियाल, लिनालूल31,पेनिसिलिन32,म्यूकोनिक एसिड33,इंडिगो34और बेतालिन35 के उत्पादन को अनुकूलित किया है।
यहां हम या तो एपिसोमल या जीनोमिक अभिव्यक्ति के लिए बहु-जीन रास्ते उत्पन्न करने के लिए MoClo टूलकिट के उपयोग का मार्गदर्शन करने के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस किट के व्यापक उपयोग के माध्यम से, हमने पाया है कि डीएनए सांद्रता का सटीक माप गोल्डन गेट प्रतिक्रिया में प्रत्येक भाग के सममोलीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम टी 7 डीएनए लिगाज़ पर टी 4 डीएनए लिगाज़ की भी सलाह देते हैं क्योंकि पूर्व में अधिक संख्या में ओवरहैंग्स36के साथ बेहतर काम करता है। अंत में, बीएसएमबीआई और बीएसएआई के किसी भी आंतरिक मान्यता स्थलों को विधानसभा से पहले हटाया जाना चाहिए या पालतू होना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, कोई भी कई आंतरिक साइटों को हटाने और एक साथ कोडन अनुकूलन प्राप्त करने के लिए भागों को संश्लेषित करने पर विचार कर सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एस सेरेविसिया में β-कैरोटीन और लाइकोपीन उत्पादन के लिए पांच जीन मार्ग व्यक्त करके इस टूलकिट का उपयोग कैसे करें। हम आगे दिखाते हैं कि इस किट से जीनोम-संपादन उपकरणों का उपयोग करके ADE2 लोकस को कैसे खटखटाया जाए। इन रंग आधारित प्रयोगों को आसान दृश्य के लिए चुना गया था। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि फ्यूजन प्रोटीन कैसे उत्पन्न करें और गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके अमीनो एसिड म्यूटेशन बनाएं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ली एट अल द्वारा विकसित MoClo आधारित क्लोनिंग किट एक से पांच प्रतिलेखन इकाइयों की त्वरित असेंबली के लिए एक बहु-जीन प्लाज्मिड में या तो खमीर जीनोम में प्रतिकृति या एकीकरण के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन प्रदान कर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रिसर्च फाउंडेशन फॉर स्टेट यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क (अवार्ड #: 71272) और यूनिवर्सिटी एट बफेलो (अवार्ड #: 000077) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Referências
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genética. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker’s yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M., Valla, S., Lale, R. . DNA Cloning and Assembly Methods. 1116, 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R., et al. . The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. 11, 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
