Hurtig samling af multigenkonstruktioner ved hjælp af modulær golden gate-kloning

Summary

Målet med denne protokol er at give en detaljeret, trin-for-trin guide til samling af multi-gen konstruktioner ved hjælp af modulopbygget kloning system baseret på Golden Gate kloning. Den giver også anbefalinger til kritiske skridt for at sikre optimal montage baseret på vores erfaringer.

Abstract

Golden Gate-kloningsmetoden muliggør hurtig samling af flere gener i ethvert brugerdefineret arrangement. Det bruger type IIS-begrænsningsenzymer, der skærer uden for deres genkendelsessteder og skaber et kort udhæng. Dette modulopbyggede kloningssystem (MoClo) bruger en hierarkisk arbejdsgang, hvor forskellige DNA-dele, såsom promotorer, kodningssekvenser (CDS) og terminatorer, først klones til en indgangsvektor. Flere indgangsvektorer samles derefter i transskriberingsenheder. Flere transskriptionsenheder opretter derefter forbindelse til et multi-gen plasmid. Golden Gate kloning strategi er af enorm fordel, fordi det giver ar-mindre, retningsbestemt, og modulopbygget samling i en one-pot reaktion. Den hierarkiske arbejdsgang muliggør typisk facile kloning af en lang række multigenkonstruktioner uden behov for sekventering ud over indgangsvektorer. Brugen af fluorescerende proteinudfald gør det nemt at screene visuelt. Dette arbejde giver en detaljeret, trin-for-trin protokol til samling af multi-gen plasmider ved hjælp af gær modulopbygget kloning (MoClo) kit. Vi viser optimale og suboptimale resultater af multi-gen plasmid samling og giver en guide til screening for kolonier. Denne kloningsstrategi gælder i høj grad for metabolisk gærteknik og andre situationer, hvor multigenplasmidkloning er påkrævet.

Introduction

Syntetisk biologi har til formål at konstruere biologiske systemer med nye funktionaliteter, der er nyttige for farmaceutiske, landbrugs- og kemiske industrier. At samle et stort antal DNA-fragmenter på en høj gennemstrømningshastighed er en grundlæggende teknologi i syntetisk biologi. En sådan kompliceret proces kan opdeles i flere niveauer med faldende kompleksitet, et koncept lånt fra grundlæggende ingeniørvidenskab^1,2. I syntetisk biologi samles DNA-fragmenter normalt hierarkisk baseret på funktionalitet: (i) Delniveau: “dele” refererer til DNA-fragmenter med en bestemt funktion, såsom en promotor, en kodningssekvens, en terminator, en oprindelse af replikation; ii) Transskriptionsenheder (TU): en TU består af en promotor, en kodningssekvens og en terminator, der er i stand til at transskribere et enkelt gen iii) Multigenniveau: Et multigenplasmid indeholder flere TU’er, der ofte består af en hel metabolisk vej. Denne hierarkiske samling banebrydende af BioBrick samfund er det grundlæggende koncept for samling af store sæt af DNA’er i syntetisk biologi³.

I det seneste årti^4,5,6,7har Golden Gate-kloningsteknikken i høj grad lettet hierarkisk DNA-samling². Mange andre multi-del kloning metoder, såsom Gibson kloning⁸, ligation-uafhængig kloning (SLIC)⁹, uracil excision-baseret kloning (USER)¹⁰, ligase cykling reaktion (LCR)¹¹, og in vivo rekombination (DNA Assembler)^12,13, er også blevet udviklet hidtil. Men Golden Gate kloning er en ideel DNA-samling metode, fordi det er uafhængig af gen-specifikke sekvenser, så ar-mindre, retningsbestemt, og modulopbygget samling i en one-pot reaktion. Golden Gate kloning drager fordel af type IIS-begrænsningsenzymer, der genkender en ikke-palindromisk sekvens for at skabe forskudte udhæng uden for anerkendelsesstedet². En ligase slutter sig derefter til de udglødede DNA-fragmenter for at opnå en samling i flere dele. Anvendelse af denne kloningsstrategi på det modulære kloningssystem (MoClo) har gjort det muligt at samle op til 10 DNA-fragmenter med over 90% transformanter screenet, der indeholder den korrekt samlede konstruktion⁴.

MoClo-systemet tilbyder enorme fordele, der har fremskyndet design-build-testcyklussen for syntetisk biologi. For det første gør de udskiftelige dele det muligt for kombinatorisk kloning hurtigt at teste et stort rum af parametre. For eksempel kræver optimering af en metabolisk vej normalt cykling gennem mange initiativtagere for hvert gen for at afbalancere stien flux. MoClo-systemet kan nemt håndtere sådanne krævende kloningsopgaver. For det andet er man nødt til at sekvensere den del plasmid, men typisk ikke TU eller multi-gen plasmider. I de fleste tilfælde er screening ved koloni PCR eller begrænsning fordøjelse tilstrækkelig til verifikation på TU og multi-gen plasmid niveau. Dette skyldes, at kloning af del plasmid er det eneste skridt, der kræver PCR, som ofte introducerer mutationer. For det tredje er MoClo-systemet ideelt til opbygning af multigenkomplekse metaboliske veje. Endelig, på grund af den universelle udhæng, kan den del plasmids genbruges og deles med hele bioengineering samfund. I øjeblikket MoClo kits er tilgængelige for planter^{14,15,5,16,17}, svampe^{6,18,19,20,21,22}, bakterier^{7,23,24,25,26,27}, og dyr^28,29. En multi-kongerige MoClo platform er også blevet indført for nylig³⁰.

For Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.⁶ har udviklet en alsidig MoClo værktøjskasse, en glimrende ressource for gær syntetisk biologi samfund. Dette sæt leveres i et praktisk 96-brønds format og definerer otte typer udskiftelige DNA-dele med en forskelligartet samling af velkaraktererede promotorer, fluorescerende proteiner, terminatorer, peptidmærker, markeringsmarkører, replikations oprindelse og genomredigeringsværktøjer. Denne værktøjskasse gør det muligt at samle op til fem transskriberingsenheder i et multigenplasmid. Disse funktioner er værdifulde for gær metabolisk teknik, hvor delvis eller hele veje er over-udtrykt til at producere målrettede kemikalier. Ved hjælp af dette kit, forskere har optimeret produktionen af geraniol, linalool³¹, penicillin³², muconic syre³³, indigo³⁴, og betalain³⁵ i gær.

Her leverer vi en detaljeret, trin-for-trin protokol til at guide brugen af MoClo værktøjskassen til at generere multi-gen veje til enten episomal eller genomisk udtryk. Gennem omfattende brug af dette sæt har vi fundet ud af, at nøjagtig måling af DNA-koncentrationer er nøglen til at sikre equimolarfordelingen af hver del i Golden Gate-reaktionen. Vi anbefaler også T4 DNA ligase over T7 DNA ligase, fordi førstnævnte fungerer bedre med et større antal udhæng³⁶. Endelig skal alle interne anerkendelsessteder for BsmBI og BsaI fjernes eller tæmmes inden montering. Alternativt kan man overveje at syntetisere dele for at fjerne flere interne websteder og for at opnå samtidig codon-optimering. Vi demonstrerer, hvordan man bruger dette værktøjssæt ved at udtrykke en fem-gen vej til β-caroten og lycopen produktion i S. cerevisiae. Vi viser endvidere, hvordan man slår ADE2-locus ud ved hjælp af genomredigeringsværktøjerne fra dette sæt. Disse farvebaserede eksperimenter blev valgt for nem visualisering. Vi demonstrerer også, hvordan man genererer fusionsproteiner og skaber aminosyremutationer ved hjælp af Golden Gate-kloning.

Protocol

BEMÆRK: Den hierarkiske kloningsprotokol, der tilbydes i dette værktøjssæt, kan opdeles i tre hovedtrin: 1. Kloning af delplasmider; 2. Kloning af transskriptionsenheder 3. Kloning af plasmider med flere gener (figur 1). Denne protokol starter fra primer design og slutter med anvendelser af den klonede multi-gen plasmid. 1. Primer design til kloning af del plasmid (pYTK001): Design de forreste og omvendte primere, der indeholder flankerende nukleotid…

Representative Results

Her resultaterne af fire repliktive multi-gen plasmider til β-caroten (gul) og lycopen (rød) produktion. En integrativ multi-gen plasmid for at forstyrre ADE2 locus blev bygget, hvis kolonier er røde. Kloning af CDS’er i indgangsvektoren (pYTK001)ERG20 blev forstærket fra gær genom og de tre carotenoid gener crtE, crtYB, crtI fra plasmid pLM494<sup class="xre…

Discussion

Den MoClo baseret kloning kit udviklet af Lee et al. giver en glimrende ressource for hurtig samling af en til fem transskription enheder i en multi-gen plasmid enten for replikation eller integration i gær genom. Brugen af dette kit eliminerer den tidskrævende kloning flaskehals, der ofte eksisterer for at udtrykke flere gener i gær.

Vi testede fem forskellige betingelser for fordøjelsen / ligation cyklusser af Golden Gate kloning med T4 DNA ligase. Vi konstaterede, at 30 fordøjelsescykl…

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification