Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Summary

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Abstract

De Golden Gate-kloonmethode maakt een snelle assemblage van meerdere genen in elke door de gebruiker gedefinieerde opstelling mogelijk. Het maakt gebruik van type IIS beperking enzymen die snijden buiten hun herkenning sites en creëren een korte overhang. Dit modulaire kloonsysteem (MoClo) maakt gebruik van een hiërarchische workflow waarin verschillende DNA-onderdelen, zoals promotors, coderingssequenties (CDS) en terminators, eerst worden gekloond tot een invoervector. Meerdere invoervectoren worden vervolgens samengevoegd tot transcriptie-eenheden. Verschillende transcriptie-eenheden verbinden vervolgens met een multi-gen plasmide. De Golden Gate-kloonstrategie is van enorm voordeel omdat het littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk maakt. De hiërarchische workflow maakt het meestal mogelijk om een grote verscheidenheid aan multi-genconstructies te klonen zonder dat er een sequencing nodig is die verder gaat dan invoervectoren. Het gebruik van fluorescerende eiwituitval maakt een eenvoudige visuele screening mogelijk. Dit werk biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de gist modulair klonen (MoClo) kit. We tonen optimale en suboptimale resultaten van multi-gen plasmide assemblage en bieden een gids voor screening op kolonies. Deze kloonstrategie is zeer toepasbaar voor gist metabole engineering en andere situaties waarin multi-gen plasmide klonen vereist is.

Introduction

Synthetische biologie is gericht op het ontwikkelen van biologische systemen met nieuwe functionaliteiten die nuttig zijn voor de farmaceutische, agrarische en chemische industrie. Het assembleren van grote aantallen DNA-fragmenten op een high-throughput manier is een fundamentele technologie in de synthetische biologie. Een dergelijk ingewikkeld proces kan worden opgesplitst in meerdere niveaus met afnemende complexiteit , een concept dat is ontleend aan fundamentele ingenieurswetenschappen^1,2. In de synthetische biologie assembleren DNA-fragmenten meestal hiërarchisch op basis van functionaliteit: (i) Deelniveau: “delen” verwijst naar DNA-fragmenten met een specifieke functie, zoals een promotor, een coderingssequentie, een terminator, een oorsprong van replicatie; ii) Transcriptie-eenheden (TU)-niveau: een TU bestaat uit een promotor, een coderingssequentie en een terminator die in staat is een enkel gen te transcriberen; iii) Multigenniveau: een multigen plasmide bevat meerdere TU’s die vaak bestaan uit een volledige metabolische route. Deze hiërarchische assemblage die door de BioBrick-gemeenschap wordt geïntroduceerd, is het basisconcept voor de assemblage van grote sets DSA’s in synthetische biologie³.

In het afgelopen decennium^4,5,6,7, heeft de Golden Gate-kloontechniek de hiërarchische DNA-assemblage aanzienlijk vergemakkelijkt². Veel andere meerdelige kloonmethoden, zoals Gibson klonen⁸, ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC)⁹, uracil excisie-gebaseerd klonen (USER)¹⁰, de ligase cycling reaction (LCR)¹¹, en in vivo recombinatie (DNA Assembler)^12,13, zijn ook ontwikkeld tot nu toe. Maar Golden Gate klonen is een ideale DNA-assemblagemethode omdat het onafhankelijk is van genspecifieke sequenties, waardoor littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk is. Golden Gate klonen maakt gebruik van type IIS restrictie enzymen die een niet-palindromische sequentie herkennen om verspringende uitsteeksels buiten de herkenningsplaats te creëren². Een ligase voegt zich vervolgens bij de gegloeide DNA-fragmenten om een meerdelige assemblage te verkrijgen. Het toepassen van deze kloonstrategie op het modulaire kloonsysteem (MoClo) heeft het mogelijk gemaakt om maximaal 10 DNA-fragmenten samen te stellen met meer dan 90% transformanten gescreend met de correct geassembleerde constructie⁴.

Het MoClo-systeem biedt enorme voordelen die de ontwerp-bouw-testcyclus van synthetische biologie hebben versneld. Ten eerste stellen de verwisselbare onderdelen combinatorisch klonen in staat om een grote ruimte van parameters snel te testen. Bijvoorbeeld, het optimaliseren van een metabolische route vereist meestal fietsen door vele promotors voor elk gen om de route flux in evenwicht te brengen. Het MoClo-systeem kan dergelijke veeleisende kloontaken gemakkelijk aan. Ten tweede moet men het deel plasmide sequencen, maar meestal niet de TU of de multi-gen plasmiden. In de meeste gevallen is screening op kolonie-PCR of restrictievertering voldoende voor verificatie op TU- en multi-gen plasmideniveau. Dit komt omdat het klonen van het onderdeel plasmide de enige stap is die PCR vereist, die vaak mutaties introduceert. Ten derde is het MoClo-systeem ideaal voor het bouwen van multi-gen complexe metabolische routes. Ten slotte kan het deel plasmiden vanwege de universele uitsteeksels worden hergebruikt en gedeeld met de hele bio-engineeringgemeenschap. Momenteel zijn MoClo kits beschikbaar voor planten^{14,15,5,16,17,}schimmels^{6,18,19,20,21,22,}bacteriën^{7,23,24,25,26,27}en dieren^28,29. Een multi-koninkrijk MoClo platform is onlangs ook geïntroduceerd³⁰.

Voor Saccharomyces cerevisiaehebben Lee et al.⁶ een veelzijdige MoClo toolkit ontwikkeld, een uitstekende bron voor de gist synthetische biologie gemeenschap. Deze kit wordt geleverd in een handig 96-well-formaat en definieert acht soorten verwisselbare DNA-onderdelen met een gevarieerde verzameling goed gekarakteriseerde promotors, fluorescerende eiwitten, terminators, peptidetags, selectiemarkers, oorsprong van replicatie en genoombewerkingstools. Deze toolkit maakt de assemblage van maximaal vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide mogelijk. Deze kenmerken zijn waardevol voor gist metabolische engineering, waarin gedeeltelijke of volledige paden worden over-uitgedrukt om gerichte chemicaliën te produceren. Met behulp van deze kit hebben onderzoekers de productie van geraniol, linalool^31,penicilline^32,muconic acid^33,indigo³⁴en betalain³⁵ in gist geoptimaliseerd.

Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol om het gebruik van de MoClo-toolkit te begeleiden om multigen-paden te genereren voor episomale of genomische expressie. Door uitgebreid gebruik van deze kit hebben we ontdekt dat het nauwkeurig meten van DNA-concentraties de sleutel is tot het waarborgen van de equimolar verdeling van elk onderdeel in de Golden Gate-reactie. We raden ook de T4 DNA-ligase over de T7 DNA-ligase aan omdat de eerste beter werkt met grotere aantallen uitsteeksels³⁶. Ten slotte moeten alle interne herkenningslocaties van BsmBI en BsaI vóór de montage worden verwijderd of gedomesticeerd. Als alternatief kan men overwegen om onderdelen te synthetiseren om meerdere interne sites te verwijderen en om gelijktijdige codonoptimalisatie te bereiken. We laten zien hoe we deze toolkit kunnen gebruiken door een vijf-gen traject uit te drukken voor β-caroteen en lycopeen productie in S. cerevisiae. We laten verder zien hoe je de ADE2-locus kunt uitschakelen met behulp van de genoombewerkingstools uit deze kit. Deze op kleuren gebaseerde experimenten werden geselecteerd voor eenvoudige visualisatie. We laten ook zien hoe je fusie-eiwitten kunt genereren en aminozuurmutaties kunt maken met behulp van Golden Gate-klonen.

Protocol

OPMERKING: Het hiërarchische kloonprotocol dat in deze toolkit wordt aangeboden, kan worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: 1. Het klonen van deelplasmiden; 2. Klonen van transcriptie-eenheden (TUs); 3. Klonen van multi-gen plasmiden (Figuur 1). Dit protocol begint bij het primerontwerp en eindigt met toepassingen van de gekloonde multi-gen plasmide. 1. Primer ontwerp voor het klonen van het onderdeel plasmide (pYTK001): Ontwerp de voorwaarts…

Representative Results

Hier de resultaten van vier replicerende multi-gen plasmiden voor β-caroteen (geel) en lycopeen (rood) productie. Een integratieve multi-gen plasmide voor het verstoren van de ADE2 locus werd gebouwd, waarvan de kolonies rood zijn. CDSs klonen in de invoervector (pYTK001)ERG20 werd versterkt uit het gistgenoom en de drie carotenoïde genen crtE, crtYB, crtI van d…

Discussion

De moclo gebaseerde kloonkit ontwikkeld door Lee et al. biedt een uitstekende bron voor snelle assemblage van één tot vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide voor replicatie of integratie in het gistgenoom. Het gebruik van deze kit elimineert het tijdrovende kloonknelpunt dat vaak bestaat voor het uitdrukken van meerdere genen in gist.

We hebben vijf verschillende condities getest voor de spijsvertering/ligatie cycli van Golden Gate klonen met T4 DNA ligase. We ontdekten dat 30 …

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification