스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.
Summary
엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.
Abstract
심장 혈관 시스템은 인간의 생리학의 핵심 선수, 본문에 대부분의 조직에 영양을 제공; 혈관은 각 특정 perfused 조직에 따라 다른 크기, 구조, 표현형 및 성능에 존재합니다. 손상되거나 누락된 신체 조직을 수리하거나 대체하는 것을 목표로 하는 조직 공학 분야는 통제된 혈관신생에 의존하여 엔지니어링된 조직 내에서 적절한 혈관화를 만듭니다. 혈관 시스템이 없으면 두꺼운 엔지니어링 구조가 충분히 영양을 공급할 수 없으므로 세포 사멸, 이식 불량 및 궁극적으로 실패가 발생할 수 있습니다. 따라서, 엔지니어링 된 혈관의 행동을 이해하고 제어하는 것은 분야에서 뛰어난 도전이다. 이 작업은 3D 스캐폴드 환경에서 선박 동작을 연구하기 위한 조직적이고 반복 가능한 선박 네트워크를 생성할 수 있는 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 이 2단계 파종 프로토콜은 시스템 내의 선박이 스캐폴드 지형에 반응한다는 것을 보여 주며, 선박이 거주하는 구획 형상에 따라 독특한 발아 동작을 제시합니다. 이러한 높은 처리량 시스템에서 얻은 결과와 이해는 더 나은 3D 생체 인쇄 스캐폴드 구조 설계를 알리기 위해 적용될 수 있으며, 이를 통해 3D 프린팅을 세포화된 생물학적 환경의 기초로 사용할 때 다양한 3D 형상의 제조를 신속하게 평가할 수 없다. 더욱이, 이러한 높은 처리량 시스템에서의 이해는 급속한 약물 스크리닝의 개선, 공동 배양 모델의 급속한 발전, 혈관 시스템의 지식을 심화시키기 위해 혈관 형성에 대한 기계적 자극의 조사를 위해 활용될 수 있다.
Introduction
조직 공학 분야는 누락되거나 손상된 장기 및 조직1을대체하기 위해 엔지니어링 된 구조의 제조로 빠르게 진행되고 있습니다. 그러나 조직 영양을 위한 작동 혈관 네트워크를 생성하는 것은 여전히 뛰어난 과제로 남아 있기 때문에 완전한 기능 구조는 아직 달성되지 못했습니다. 적절한 혈관화없이, 엔지니어링 된 조직은 산소와 영양소의 수동 확산 수송에 제한, 확산 한계에 최대 실행 가능한 조직 두께를 제한, 약 200 μm2. 이러한 두께는 기능성 혈관 네트워크의 존재를 기능적 및 이식형 조직에 대한 필수 특성으로 만드는 대형 조직 결함을 복구하거나 전체 장기 제조에 적합하지 않습니다3.
혈관 계통은 다양한 혈관으로 구성되어 있으며, 다양한 크기, 표현형 및 조직으로 숙주 조직과 밀접한 관련이 있습니다. 개발 및 발아 선박에 의해 수행 된 행동, 응답 및 마이그레이션 결정을 이해하면 엔지니어링 조직에 통합을 지시 할 수 있습니다4. 현재, 체외 혈관 네트워크를 만들기위한 가장 일반적인 접근 방식은 내피 세포 (EC)와 지원 세포 (SC, 벽화 세포로 분화 할 수있는 능력)를 결합하는 것입니다. 이 환경은 세포가 혈관 네트워크2,5,6,7,8에부착, 증식 및 자가 조립할 수 있도록 화학적및물리적 신호를 제공한다. 공동 배양시, SC는 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 분비하면서 관 구조를 형성하는 IC에 기계적 지원을 제공합니다. 더욱이, 두 세포 유형 간의 상호 작용은 관형성, 혈관 발아 및 이주를 촉진하며, SC 성숙 및 분화 이외에 α-부드러운 근육 액틴 발현(αSMA) 벽화 세포4로의기양양하게 된다. 선박 네트워크 개발은 하이드로겔, 다공성 폴리머 스캐폴드 또는 이들의 조합을 사용하여 생성된 3D 환경에서 가장 일반적으로 연구된다. 후자의 옵션은 셀 친화적 인 환경과 세포와 ECM9모두에 필요한 기계적 지원을 동일하게 제공합니다.
하이드로겔(10),하이드로겔스-스캐폴드 조합11,12,2D 플랫폼, 미세유체장치(13)에세포를 공동 배양하는 등 혈관 발달을 연구하기 위해 많은 양의 작업이 수행되었다. 그러나, 하이드로겔은 세포가 가해지는힘(14)에의해 용이하게 변형될 수 있고, 2D 및 미세유체시스템은 보다 추정가능한반응(15,16)을얻기 위해 자연에 가까운 환경을 재현하지 못한다. 형성 선박이 주변 환경에 어떻게 반응하는지 이해하면 선박 개발을 예측 가능한 방식으로 안내할 수 있는 엔지니어링 환경을 제작할 수 있는 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 혈관 형성 현상을 이해하는 것은 스테레오리소그래피, 디지털 프로젝션 리소그래피, 연속 액체 인터페이스 생산, 3D 용융 전자 제트 라이팅, 솔루션 기반 3D 일렉트로젯 쓰기, 그리고 신흥 바이오 프린팅기술17,18,19,20, 20,21과같은 서브미칸 -미크로닌 스케일 제조 기술의 급속한 출현과 보조를 맞추기 위해 특히 중요합니다. 혈관 생물학의 심화된 이해와 이러한 미세 제조 기술의 제어를 조정하는 것은 표적 조직에 적합한 엔지니어링 혈관의 생성에 핵심입니다.
여기서, 우리는 주변 비계 기하학에 새로운 형성 및 발아 선박의 반응을 연구하는 3D 시스템을 제시, 그들의 새싹 기원과 후속 마이그레이션(22)를관찰. 테셀레이트 구획 지오메트리와 2단계 파종 기술이 있는 3D 스캐폴드를 활용하여 명확하고 쉽게 분석할 수 있는 고도로 조직화된 혈관 네트워크를 만드는 데 성공했습니다. 테셀레이션 된 형상은 로컬 환경에 반응하는 선박을 포함하는 개별 유닛을 갖춘 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 다색 EC를 사용하여, 우리는 구획 형상 및 SC위치(22)와상관관계가 있는 새싹 형성 기원 및 후속 마이그레이션 패턴을 추적하였다.
제안된 프로토콜은 혈관화 동작에 대한 기하학적 단서의 영향을 분석할 준비가 되어 있지만, 이 방법은 다양한 새로운 응용 분야에 확장및 적용할 수 있습니다. 테셀레이션 스캐폴드와 쉽게 이미지할 수 있는 네트워크는 다양한 IC 및 SCs 상호 작용, 특정 장기 세포의 추가 및 혈관 네트워크와의 상호 작용, 혈관 네트워크에 대한 약물 효과 등을 간단하게 분석할 수 있게 해주었습니다. 우리의 제안 된 시스템은 매우 다양하고 간단한 제작 및 처리의 결과.
Protocol
Representative Results
Discussion
엔지니어링 된 조직에 내장 된 내에 풍부한 혈관에 대한 필요성은 생존과 적절한 기능1을구성하는 데 중요합니다. 혈관 시스템을 엔지니어링하는 것은 방대한 양의 연구의 초점이었지만, 많은 사람들이조사하고 24를이해하기 위해 남아 있습니다. 특히, 특정 조직을 재현할 때, 마이크로혈관은12에따라 행동하고 구성해야 한다. 마이크로혈관 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미시간 대학에서 자금 지원 – 연구를위한 이스라엘 파트너십. 저자는 우리 머들러, 리어 데비, 갈리아 벤 데이비드의 큰 도움과 지원에 감사드립니다, 나딘 왕, 박사와 필라 헤레라 피에로, 미시간 대학의 루리 나노 패브릭 시설의 박사, 뿐만 아니라 루이스 솔로리오, 사진 촬영 기술의 계몽 에 대한 박사.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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