Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos
Summary
Los tejidos diseñados dependen en gran medida de las redes vasculares adecuadas para proporcionar nutrientes y gases vitales y eliminar los desechos metabólicos. En este trabajo, un protocolo de siembra escalonada de células endoteliales y células de apoyo crea redes vasculares altamente organizadas en una plataforma de alto rendimiento para estudiar el comportamiento de los vasos en desarrollo en un entorno 3D controlado.
Abstract
El sistema cardiovascular es un jugador clave en la fisiología humana, proporcionando nutrición a la mayoría de los tejidos en el cuerpo; los recipientes están presentes en diversos tamaños, estructuras, fenotipos, y funcionamiento dependiendo de cada tejido perfundido específico. El campo de la ingeniería de tejidos, que tiene como objetivo reparar o reemplazar los tejidos corporales dañados o faltantes, se basa en la angiogénesis controlada para crear una vascularización adecuada dentro de los tejidos diseñados. Sin un sistema vascular, las construcciones de ingeniería gruesas no se pueden nutrir suficientemente, lo que puede resultar en muerte celular, eninjerto deficiente y, en última instancia, fracaso. Por lo tanto, la comprensión y el control del comportamiento de los vasos sanguíneos diseñados es un desafío excepcional en el campo. Este trabajo presenta un sistema de alto rendimiento que permite la creación de redes de buques organizadas y repetibles para estudiar el comportamiento de los buques en un entorno de andamios 3D. Este protocolo de siembra en dos pasos muestra que los recipientes dentro del sistema reaccionan a la topografía del andamio, presentando comportamientos de brotación distintivos dependiendo de la geometría del compartimiento en el que residen los recipientes. Los resultados obtenidos y la comprensión de este sistema de alto rendimiento se pueden aplicar con el fin de informar mejores diseños de construcción de andamios bioimpresos en 3D, en los que la fabricación de varias geometrías 3D no se puede evaluar rápidamente cuando se utiliza la impresión 3D como base para entornos biológicos celularizados. Además, la comprensión de este sistema de alto rendimiento se puede utilizar para la mejora de la investigación rápida de la droga, el desarrollo rápido de los modelos de las co-culturas, y la investigación de estímulos mecánicos en la formación del vaso sanguíneo para profundizar el conocimiento del sistema vascular.
Introduction
El campo de la ingeniería de tejidos está progresando rápidamente hacia la fabricación de construcciones de ingeniería para reemplazar órganos y tejidos perdidos o dañados1. Sin embargo, las construcciones completamente funcionales todavía tienen que ser alcanzadas, en parte, puesto que la generación de las redes vasculares operacionales para la nutrición del tejido sigue siendo un desafío excepcional. Sin la vascularización adecuada, los tejidos diseñados se limitan a un transporte de difusión pasiva de oxígeno y nutrientes, limitando el espesor máximo viable del tejido al límite de difusión, aproximadamente 200 μm2. Tales espesores no son adecuados para reparar defectos tisulares grandes o para la fabricación completa de órganos, lo que hace que la presencia de una red vascular funcional sea una característica obligatoria para los tejidos funcionales e implantables3.
El sistema vascular se compone de una amplia variedad de vasos sanguíneos, con diversos tamaños, fenotipos, y organización, estrechamente relacionados con el tejido del anfitrión. Comprender el comportamiento, la respuesta y las decisiones de migración tomadas por los vasos en desarrollo y germinación puede indicar su integración en los tejidos deingeniería 4. Actualmente, el enfoque más común para crear redes vasculares in vitro es la combinación de células endoteliales (CE) con células de apoyo (SCs, con la capacidad de diferenciarse en células murales), sembradas dentro de un micro-ambiente tridimensional. Este entorno proporciona señales químicas y físicas para permitir que las células se adhieran, proliferen y seautoensamblan en redes de vasos2,5,6,7,8. Cuando se co-cultivan, los SCs secretan proteínas de la matriz extracelular (ECM) mientras proporcionan soporte mecánico a los CE, que forman las estructuras tubulares. Además, una interacción cruzada entre ambos tipos de células promueve la tubulogénesis, la brotación de vasos y la migración, además de la maduración y diferenciación de las SCs en células murales que expresan actina muscular α (αSMA)4. El desarrollo de redes de buques se estudia más comúnmente en entornos 3D creados con hidrogeles, andamios poliméricos porosos o una combinación de ellos. Esta última opción proporciona igualmente un entorno amigable con las células y el soporte mecánico requerido tanto para las células como para el ECM9.
Se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo para estudiar el desarrollo vascular, incluyendo el co-cultivo de las células en hidrogeles10,combinaciones hidrogeles-andamios11,12,plataformas 2D, y dispositivos microfluídicos13. Sin embargo, los hidrogeles pueden ser fácilmente deformados por las fuerzas ejercidas por las células14,mientras que los sistemas 2D y microfluídicos no logran recrear un ambiente más cercano a la naturaleza para obtener una respuesta más extrapolable15,16. Comprender cómo reaccionan los buques en formación a su entorno circundante puede proporcionar información crítica que podría permitir la fabricación de entornos de ingeniería con la capacidad de guiar el desarrollo del buque de una manera predecible. Comprender los fenómenos de formación vascular es especialmente crítico para mantener el ritmo de la rápida aparición de técnicas de fabricación a escala submicrónica a micron, como la estereolitografía, la litografía de proyección digital, la producción continua de interfaces líquidas, la escritura de electroayección de fusión 3D, la escritura de electrorreactor 3D basada en soluciones y las técnicas emergentes de bioimpresión17,18,19,20,21. Alinear el control de estas técnicas de microfabricación con una comprensión más profunda de la biología vascular es clave para la creación de una vasculatura de ingeniería adecuada para un tejido diana.
Aquí, presentamos un sistema 3D para estudiar la respuesta de los nuevos vasos de conformado y brotación a la geometría del andamio circundante, observando su origen de brote y posterior migración22. Mediante la utilización de andamios 3D con geometrías compartimentales teseladas, y una técnica de siembra de dos pasos, tuvimos éxito en crear redes vasculares altamente organizadas de una manera clara y fácil de analizar. Las geometrías teseladas proporcionan un sistema de alto rendimiento con unidades individuales que contienen buques que responden a su entorno local. Utilizando ECs multicolores, rastreamos los orígenes de la formación de brotes y los patrones de migración posteriores, correlacionados con la geometría del compartimiento y la ubicación de los SCs22.
Aunque el protocolo propuesto se ha preparado para analizar los efectos de las señales geométricas sobre el comportamiento de vascularización, este enfoque se puede ampliar y aplicar a una variedad de nuevas aplicaciones. El andamio teselado y las redes fácilmente perceptibles permiten el análisis directo de la interacción de diferentes CE y SCs, la adición de células orgánicas específicas y su interacción con las redes vasculares, el efecto de los fármacos en las redes vasculares y más. Nuestro sistema sugerido resulta muy versátil y de fabricación y procesamiento simple.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necesidad de una vasculatura rica dentro de los tejidos incrustados en la ingeniería es fundamental para la supervivencia de la construcción y la función adecuada1. Aunque la ingeniería del sistema vascular ha sido el foco de una gran cantidad de investigación, queda mucho por investigar y entender24. En particular, al recrear un tejido específico, la microvasculatura debe comportarse y organizarse en consecuencia12. El enfoque más común p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por fondos de la Asociación para la Investigación universidad de Michigan – Israel. Los autores desean agradecer a Uri Merdler, Lior Debbi y Galia Ben David por su gran ayuda y apoyo, a Nadine Wang, Ph.D. y Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. de la Lurie Nanofabrication Facility en la Universidad de Michigan, así como a Luis Solorio, Ph.D. por sus esclarecedoras discusiones sobre técnicas de fotolitografía.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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