Alle dyreforsøg blev udført under licensen ZH152/17 i overensstemmelse med standarder og forskrifter fra Cantonal Ethics Commission Zürich og EPIC-dyrefaciliteten ved Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zürich. BEMÆRK: Denne protokol starter med sletning af H19- og IG-DMR’er i phaESCs. Yderligere oplysninger om, hvordan du opretter phaESC-linjer, finder du i de offentliggjorte rapporter10,13. Figur 1A inser en oversigt over og tidsramme for denne protokol (trin 1-14). medier, løsninger og buffere er angivet i tabel 1. Proceduren for etablering af DKO-phaESC-linjer (trin 1-6) er vist i figur 1B, og strategien for konstruktion af halvklonede embryoner (trin 7-14) er beskrevet i figur 1C. 1. Transfekt af plasmider til sletning af H19-DMR og IG-DMR i phaESCs Forbered CRISPR/Cas9 plasmider til co-expression af Cas9-kerner, og guide RNA’er til at målrette sletninger af H19-DMR og IG-DMR. Ligate fire par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R anført i tabel 2) i pX330 plasmider.BEMÆRK: Se den offentliggjorte protokol om den detaljerede procedure for udarbejdelse af disse 4 CRISPR/Cas9 plasmids14. Alternativt er plasmider, der er tilgængelige for generelle musestammer, også tilgængelige via et lager (Tabel over materialer). Overfladen af en brønd af en 6-brønds plade belægges med 1 ml gelatineopløsning på 0,2% ved inkubation ved 37 °C i 10 min. Plade 2 × 105 wildtype phaESCs på gelatine-belagt godt i haESC medium uden antibiotika, og inkubere pladen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære i 1 dag.BEMÆRK: Antibiotika udelades fra mediet for at øge effektiviteten af den efterfølgende lipofection. Vi brugte wildtype phaESCs ved passage 10. Vi anbefaler at bruge tidlige passage phaESCs, men en række passage nummer er blevet anvendt med succes8. Sammenhængen mellem passage nummer og effektiviteten af at opnå semi-klonede embryoner og mus er i øjeblikket ikke kendt. Transfektfasede phaESC’er i brønden på en 6-brønds plade (fra trin 1.3) med 6 plasmider samtidig ved hjælp af lipofection reagens: 50 ng piggyBac plasmid med cag-egfp transgene, 50 ng piggyBac transponerer plasmid og 600 ng af hver af de 4 CRISPR/Cas9 plasmider (fra trin 1.1). Der henvises til fabrikantens protokol om den detaljerede procedure for oversættelsen.BEMÆRK: To piggyBac plasmider bruges til at integrere en transposon for allestedsnærværende udtryk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) i genomet af phaESCs. Hvis GFP-mærkning af cellerne ikke er påkrævet, kan disse to plasmider erstattes af en CRISPR/Cas9 plasmid for forbigående ekspression af fluorescensproteiner (f.eks. pX458 plasmid) i stedet for en af pX330 plasmiderne. Forbigående EGFP-udtryk kan derefter bruges til sortering af transfekterede celler. To dage efter transfekten aspireres mediet og tilsættes 800 μL trypsin. Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min. Derefter tilsættes 2 mL vaskebuffer for at slukke trypsin og pipette flere gange for at opnå en enkelt celleaffjedring. Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min, og fjern supernatanten. Cellepellet blev genbrugt i 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer suppleret med 15 μg/mL Hoechst 33342.BEMÆRK: For at reducere den potentielle toksicitet af Hoechst 33342 er der anvendt 1 μg/mL Hoechst 33342 og 50 μM verapamil i stedet for 15 μg/mL Hoechst 3334215. Celleaffjedringen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringen til et 5 mL rør gennem en cellestængelhætte, og røret holdes ved 4 °C, indtil det er klar til brug i næste trin (afsnit 2). 2. Enkeltcellebelægning af transfected phaESCs ved hjælp af et flowcytometer En dag før sortering af de transfected phaESCs, plade bestrålet mus embryonale fibroblaster (MEF) på gelatine-belagt 96-godt plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Typisk er 6 plader parate til at etablere en phaESC-linje med målrettede sletninger. Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære.BEMÆRK: Bestrålede MEF’er er kommercielt tilgængelige. Vi bruger MEF’er afledt af E12.5 embryoner af DR4 mus. Selvom haESC’er kan vokse på gelatinebelagte plader uden MEF’er, anbefaler vi MEF’er for at øge levedygtigheden af sorterede enkelt haESC’er. På sorteringsdagen aspireres MEF-mediet fra 96-brøndspladerne, og der tilsættes 120 μL frisk haESC-medium pr. brønd. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Opret en cellesortering med en dyse på 100 μm i overensstemmelse med producentens anvisninger. En 355 nm UV-laser og en 488 nm blå laser anvendes til excitation af henholdsvis Hoechst 33342 og EGFP fluorescens.BEMÆRK: Alternativt kan Hoechst 33342 detekteres ved excitation med 405 nm. Sorter de transfected phaESCs i 5 mL-røret (fra trin 1.10) ved hjælp af en port til indsamling af haploide celler i G1/S-fasen, der viser EGFP-udtryk. Sæt en enkelt celle i hver brønd af 96-brøndspladerne fra trin 2.2.BEMÆRK: Påvisning af Hoechst 33342-farvning skelner generelt mellem 3 toppe af celler med et 1n-, 2n- og 4n DNA-indhold, som svarer til haploide celler i G1-fase, en blanding af haploide celler i G2/M-fase og diploide celler i G1-fase og diploideceller i henholdsvis G2/M-fasen. Haploide celler i G1/S-fasen identificeres som toppen med lavere intensitet af Hoechst 33342 fluorescens. Et repræsentativt resultat og en sorteringsport er vist i figur 2A. Efter plating inkuberes 96-brøndspladerne ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. 3. Subkloning af transfected phaESCs Tre dage efter enkeltcellebelægning kan kolonier observeres i flere brønde af 96-brøndspladerne under et mikroskop. Marker brøndene, hvor kun enkelte kolonier vokser.BEMÆRK: Det er vores erfaring, enkelt kolonier blev observeret i 20%-40% af brøndene i 96-brønd plader. På dag 4 efter enkeltcellebelægning skal halvdelen af mediet erstattes med nyt haESC-medium i brøndene med enkelte kolonier. En dag før passaging (på dag 4 eller 5 efter enkelt cellebelægning), bestrålede plade MEF’er på gelatinebelagte 96-brøndsplader med en densitet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Efter 5 eller 6 dages enkeltcellebelægning skal du vælge brønde af de 96-brøndsplader, der indeholder enkelte kolonier med en diameter på over 150 μm.BEMÆRK: Der vælges fortrinsvis ca. 100 brønde til at etablere en phaESC-linje med de målrettede DMR-sletninger. Aspirere mediet i de valgte brønde og tilsæt 30 μL trypsin. 96-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min. Derefter tilsættes 30 μL vaskebuffer til hver brønd for at slukke trypsinen. Tilsæt 140 μL haESC medium i hver brønd, og pipette flere gange for at opnå enkelte celler. Indsug MEF-mediet fra brøndene på de 96-brøndsplader, der er forberedt i trin 3.3. Overfør phaESC’erne fra hver brønd fra trin 3.6 til en frisk brønd af den nye 96-brønds plade fra trin 3.7. 96-brøndspladerne, der indeholder phaESC-underkluder ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære, inkuberes. Den næste dag aspireres hele mediet fra hver brønd, og der tilsættes 120 μL nyt haESC-medium. Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. En dag før cellerne bliver sammenflydende for passaging, plade bestrålede MEF’er på gelatine-belagt 24-brønd plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Når phaESC’er er blevet sammenflydende til passaging, aspirere mediet og tilsæt 30 μL trypsin. 96-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i 5 min. Tilsæt 90 μL vaskebuffer i hver brønd for at slukke trypsinen. Pipette flere gange for at få enkelte celler. Aspirat MEF-mediet fra brøndene på 24-brøndspladerne fra trin 3.11, og tilsæt 600 μL frisk haESC-medium. 60 μL af suspensionen af phaESC-delkloner overføres fra hver brønd i trin 3.13 til en ny brønd af 24-brøndspladerne fra trin 3.14. Hold den resterende suspension af hver phaESC-underkling til DNA-ekstraktion og genotyping i trin 4. 24-brøndspladerne inkuberes med phaESC-underkluderne ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. En dag før cellekulturerne når tætheden for passaging, plade bestrålede MEF’er på gelatine-belagt 6-brønd plader med en densitet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF medium. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Når phaESCs bliver sammenflydende nok til passaging, aspirere mediet og tilsæt 250 μL trypsin. 24-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C i 5 min.BEMÆRK: Efter genotyping i trin 4.9 skal kun phaESC-linjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR passeres. Der tilsættes 750 μL vaskebuffer i hver brønd for at slukke trypsinen. Pipette flere gange for at opnå en enkelt celle suspension. Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min, fjern supernatanten, og genbrug cellepillen i 2 mL haESC-medium. Indsug MEF-mediet fra brøndene på 6-brøndspladerne fra trin 3.17. Overfør phaESC-affjedringen fra hvert rør fra trin 3.20 til en ny brønd. Opbevar pladerne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Udvid celleklonene ved at gentage trin 3.17 til 3.21 og øge pladestørrelsen og mængderne af trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Forbered en T25 kolbe for hver subklonet phaESC-linje af MEF’er til trin 5.BEMÆRK: Vi anbefaler, at der fryses en aliquot af hver subklonet phaESC-linje i 300 μL frysemedium, og at der opbevares kryostock i flydende nitrogenopbevaring, før du fortsætter til trin 5. 4. Første genotyping af subklonede phaESC-linjer med MEF’er For at udtrække genomisk DNA fra den resterende celleaffjedring fra trin 3.15 tilsættes 200 μL lysis buffer til hver brønd af 96-brøndspladerne. Overfør celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. Skyl hver brønd med yderligere 200 μL lysis buffer for at genvinde alle resterende celler og opsamles i samme 1,5 mL rør. 1,5 mL røret inkuberes ved 55 °C i 3 timer med blanding. Efter inkubation tilsættes 460 μL isopropanol til hvert 1,5 mL rør og blandes forsigtigt, indtil et DNA-bundfald bliver synligt. Centrifuge rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Dna-pillerne vaskes med 200 μL 70% ethanol. Centrifuge rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Rørene tørres i luften i 10 minutter og genbruges derefter DNA’et i 20 μL vand. Udfør polymerase kædereaktion (PCR) ved hjælp af termotabel DNA polymerase efter producentens protokol.BEMÆRK: Primerparrene til PCR er anført i tabel 2 og bruges som følger: H19-DMR-P1 og P3 (407 basispoint for slettet H19-DMR); H19-DMR-P2 og P3 (623 basispoint for vildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 og P3 (319 basispoint for slettet IG-DMR); IG-DMR-P2 og P3 (492 bp for wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen for PCR for alle primerpar er som følger: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min. 72 °C. Længden af forstærkede DNA-fragmenter for H19- DMR-og IG-DMR-sletningerneviser en vis variation på grund af ikke-homolog endeslutning forbundet med CRISPR/Cas9-medieret redigering. PhaESCs blev dyrket med MEF’er, som indeholder wildtype H19-DMR og IG-DMR DNA. Derfor er primerpar af H19-DMR-P2/P3 og IG-DMR-P2/P3, som forstærker dna-fragmenter af vild naturtype, ikke informative. Disse primerpar er dog inkluderet som kontroller og bør give et bånd i alle reaktioner. Analyser PCR-fragmenterne ved agarosegelelektroforese. Der henvises til den offentliggjorte protokol om den detaljerede procedure for elektroforese16. Identificer cellelinjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR. Et repræsentativt billede af elektroforese er vist i figur 2B.BEMÆRK: I vores tilfælde blev otte cellelinjer med sletninger af både H19-DMR og IG-DMR identificeret blandt 135 subklonede phaESC-linjer. 5. Haploidcellerensning af subklonede phaESC-linjer Når de subklonede phaESC-kulturer i T25-kolberne fra trin 3.22 bliver tætte nok til passaging, aspireres mediet og tilsættes 1,5 mL trypsin. Kolben inkuberes ved 37 °C i 5 min. Derefter tilsættes 4,5 mL vaskebuffer og pipette flere gange for at opnå en enkeltcellet suspension. Hver celleaffjedring overføres til et 15 mL rør, og røret centrifuges ved 160 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellepillerne genbruges i 400 μL haESC vedligeholdelsesbuffer suppleret med 15 μg/mL Hoechst 33342. Celleaffjedringerne inkuberes ved 37 °C i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringerne til et 5 mL rør gennem en celle sihætte. Cellens sihætte skylles med yderligere 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer, og de resterende celler opsamles i samme 5 mL rør. Røret holdes ved 4 °C, indtil det er klar til sortering. Opsæt et flowcytometer med en 100 μm dyse i overensstemmelse med producentens anvisninger.BEMÆRK: Hoechst 33342 kan påvises ved excitation ved 405 nm. Her bruges en 355 nm UV-laser til påvisning af Hoechst 33342. Opsæt celleaffjedringen (fra trin 5.3) og et nyt 15 mL rør, der indeholder 2 mL haESC-vedligeholdelsesbuffer til opsamling af sorterede celler i flowcytometeret. Start analysen, og opsæt sorteringsporten til indsamling af haploide celler i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A for at få oplysninger om G1/S-fasens fase ESC-population.BEMÆRK: Nogle subklonede phaESC-linjer må ikke indeholde haploide celler på grund af fuldstændig diploidisering eller fejlagtig belægning af diploidceller i trin 2. Hvis der ikke observeres haploide celler i G1/S-fasen, skal du gå videre til en anden prøve uden sortering. I vores tilfælde indeholdt 5 cellelinjer haploide celler, og 3 cellelinjer indeholdt kun diploidceller ud af 8 subklonede phaESC-linjer. Efter cellesortering tilsættes 5 mL vaskebuffer langs væggen på 15 mL opsamlingsrøret. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Vælg en plade af passende størrelse til dyrkning afhængigt af antallet af sorterede celler. Brug en enkelt brønd med en 96-brønds plade, en 24-brønds plade og en 12-brønds plade til at kultur 1.000-40.000 celler, henholdsvis 40.000-200.000 celler og 200.000-400.000 celler. Cellepellet blev genbrugt i henholdsvis 120 μL, 600 μL og 1,2 mL haESC-medium.BEMÆRK: Plade cellerne ved høj densitet, fordi lav sammenløb kan forårsage celledød af cellerne efter sortering. Fra dette tidspunkt dyrkes phaESC’er på gelatinebelagte brønde uden MEF’er for at lette genotyping i trin 6 og den efterfølgende ansøgning om intracytoplasmisk injektion fra trin 9. Efter at celleaffjedringen er blevet overført til en gelatinebelagt brønd af passende størrelse, inkuberes pladen ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. Fortsæt med at udvide phaESC-kulturerne ved at gentage trin 3.18 til 3.21 med stigende pladestørrelser og stigende mængder trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Cellerne er dyrket på gelatine-belagt brønde uden MEFs. For hver subklonet phaESC-linje skal du forberede en kultur i en brønd af en 24-brønds plade og en brønd af en 6-brønds plade til henholdsvis trin 6 og 9.BEMÆRK: Nogle celler i hver subklonet phaESC-linje bør fryses i 300 μL frysemedium som kryostock i en flydende nitrogentank, inden de går videre til trin 9. 6. Anden genotyping af subklonede phaESC-linjer uden MEF’er BEMÆRK: Der udføres en anden runde genotyping for at bekræfte, at de subklonede phaESC-linjer har sletninger af både H19- og IG-DMR’er, og at vilde alleler er fraværende efter fjernelsen af MEF’er. Bekræft under mikroskopet, at kulturerne i brønde af 24-brøndspladerne fra trin 5.11 er fri for MEF’er.BEMÆRK: Hvis MEF’er observeres, er det nødvendigt at fortsætte med at passere kulturerne, indtil MEF’er er forsvundet for at undgå at forurene PCR med wildtype DNA fra MEF’er. Aspirere mediet fra sammenflydende kulturer og tilsæt 400 μL lysis buffer per brønd af 24-brønds plade. Efter pipettering flere gange overføres celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. 1,5 mL røret inkuberes ved 55 °C i 3 timer med blanding. Efter inkubation tilsættes 400 μL isopropanol til 1,5 mL-røret og blandes forsigtigt, indtil et DNA-bundfald bliver synligt. Centrifuge røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Dna-pillerne vaskes med 200 μL 70% ethanol. Centrifuge røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Røret tørres i luften i 10 minutter og genbruges derefter DNA’et i 50 μL vand. Udfør genotyping PCR efter trin 4.7 og gel elektroforese i trin 4.8 for at identificere cellelinjer, som besidder sletninger af både H19- og IG-DMR’er og er fri for vilde alleler.BEMÆRK: Et billede af en typisk anden genotypinganalyse er vist i figur 2B som reference. I vores tilfælde var alle 5 cellelinjer, der blev valgt efter haploid cellerensning (trin 5), fri for wildtype-alleler og havde kun sletnings allelerne i H19- og IG-DMR’ er. Brug de subklonede phaESC-linjer, der er valgt efter denne anden genotyping, som DKO-phaESC-linjer. 7. Superovulation af mus Til produktion af MII oocytter skal superovulation startes ved intraperitoneal injektion af 5 IE af gravid mare serum gonadotropin (PMSG) opløsning i hver B6D2F1 hunmus (4-5 uger gammel) 63-65 timer før oocytsamling.BEMÆRK: B6D2F1-musestammen anbefales til denne protokol, fordi B6D2F1 oocytter tåler intracytoplasmisk injektion godt og udviser et højt udviklingspotentiale efter proceduren17. 48 timer efter PMSG-injektion injicerer intraperitoneally 5 IE human chorionic gonadotropinopløsning i hver mus. 8. Oocyte kollektion Der fremstilles en 4-brønds plade indeholdende 700 μL hyaluronidase medium i en brønd og 700 μL M2 medium i de resterende 3 brønde. Derudover tilberedes en 6 cm skål med 7 mL M2 medium og en center-well skål med 900 μL M16 medium. Forvarm tallerkenen og retterne ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. På dagen for den intracytoplasmiske injektion aflives de superovulated hunner (fra trin 7.2) ved enten cervikal dislokation eller CO2 indånding omkring kl. 8 om morgenen. Dissekere ovidukterne ved hjælp af pincet og saks. Placer ovidukterne i 6 cm skålen med M2 medium. Slip cumulus-oocytkomplekser (COCs) ved at rive ampulla af oviducts med en 30 G nål. Overfør COC’er til forvarmet hyaluronidase-medium og hold ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. Efter 2-3 min, indsamle cumulus-fri oocytter med en mund pipette og vask oocytter 3 gange ved at overføre dem til frisk M2 medium i de andre 3 brønde af 4-brønds plade. Metafase II (MII) oocytter, som har de første polære kroppe, opsamles i en skål med M16-medium og holder pladen ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære, indtil den anvendes til intracytoplasmisk injektion i trin 12. 9. Behandling og indsamling af DKO-phaESC’er Forbered en DKO-phaESC kultur i en brønd af en 6-brønds plade uden MEF’er ved 60-80% sammenløb en dag før den intracytoplasmiske injektion (fra trin 5.11). For at fremkalde cellecyklusstop i M-fase aspireres mediet fuldstændigt, og der tilsættes 2 ml haESC-medium indeholdende 0,05 mg/mL demecolcine. Efter 8 timers demecolcine behandling, aspirere mediet og tilsæt 800 μL trypsin. Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 5 min., tilsæt derefter 2 mL vaskebuffer for at slukke trypsinen og pipette flere gange for at opnå en enkeltcellet suspension. Overfør celleaffjedringen til et 15 mL rør. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten. Cellepellet blev genbrugt i 400 μL haESC-vedligeholdelsesbuffer indeholdende 15 μg/mL Hoechst 33342. Celleaffjedringen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære i 15 min. Efter inkubationen overføres celleaffjedringen til et 5 mL rør gennem en cellesienhætte, og røret holdes ved 4 °C, indtil cellen sorteres i trin 10. 10. Rensning af M-fase-anholdte DKO-phaESCs Opsæt et flowcytometer med en 100 μm dyse i overensstemmelse med producentens anvisninger.BEMÆRK: Hoechst 33342 kan påvises ved excitation ved 405 nm. Her bruges en 355 nm UV-laser til påvisning af Hoechst 33342. Opret M-fase-anholdt DKO-phaESCs fra trin 9.7 og starte analysen. Vælg en passende sorteringsport til opsamling af haploide M-faseceller (2n) fra prøven behandlet med demecolcine.BEMÆRK: Efter demecolcine-behandlingen forventes der 2 cellepopulationer svarende til haploide og diploide M-fase-anholdte celler som vist i figur 3B. Cellecyklusarreationen efter demecolcine-behandlingen er afsluttet, og der observeres således ingen haploid 1n DNA-top. Dette er vigtigt, da haploid M-fase celler og diploid G1 celler har samme DNA-indhold (2n) og ville producere overlappende toppe. Opsæt et 15 mL rør, der indeholder 2 mL haESC vedligeholdelsesbuffer til opsamling af de sorterede celler i flowcytometeret. Start cellesortering. Efter cellesortering tilsættes 5 mL vaskebuffer langs væggen i opsamlingsrøret. Centrifuge røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten. Resuspend cellerne i en passende mængde haESC vedligeholdelse buffer for at opnå en endelig koncentration på 5 x 105 celler / mL. Overfør celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. Hold røret på is, indtil det er klar til intracytoplasmisk injektion i trin 12. 11. Forberedelse af holde- og mikroinjektionspipetter BEMÆRK: Til udførelse af den intracytoplasmiske injektion (trin 12) kræves der flere holde- og mikroinjektionspipetter (figur 4A). Disse pipetter kan købes efter skræddersyet efterspørgsel fra en kommerciel leverandør eller fremstillet af egnede glaskapillærer ved hjælp af en micropipette-aftrækker og en mikroforge. Træk borosilikat glas kapillærer på en micropipette puller. For at trække borosilikatglaskapillærer uden glødetråd (0,78 x 1,00 x 80 mm) angives følgende parametre for en flammende vandret aftrækker (Tabel over materialer) som reference men vil variere for andre instrumenter og glas kapillær typer: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 og Pressure 200 for at holde pipetter; Heat 510 (Rampetest 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 og Pressure 200 for microinjection pipetter.BEMÆRK: De optimale parametre skal defineres individuelt, fordi flere faktorer, herunder fugtighed, modellen af en micropipette-aftrækker og partiet af glaskapillærerne kan påvirke sprøjtens form. En langstrakt form med en gradvis tilspidsning bør være rettet mod. Forberedelse af holdepipetter Sæt en trukket kapillær tilberedt i trin 11.1 til en mikroforge. Placer kapillæren over glasperlen på glødetråden, og sænk kapillæren for at komme i kontakt med glasperlen, mens filamentet opvarmes. Bryd kapillæren ved at slukke for opvarmningen og løsne den fra glasperlen, så dens ydre diameter er 60-100 μm. Placer kapillærspidsen vandret mod glasperlen på glødetråden. Filamentet opvarmes, så kapillærspidsens indvendige diameter kan smelte til en diameter på 10-20 μm. Flyt kapillæren, så glasperlen placeres på et punkt ~1 mm fra kapillærspidsen uden kontakt. Varm glødetråden, så kapillæren kan bøjes i en vinkel på 20°. Afmonter kapillæren, hed en holdepipette, fra mikroforge.BEMÆRK: For at måle kapillærens størrelse monteres der helst en reticle i mikroforseglet. Fremstilling af mikroinjektionspipetter Sæt en trukket kapillær tilberedt i trin 11.1 til en mikroforge. Placer kapillæren over glasperlen på glødetråden, og sænk kapillæren for at komme i kontakt med glasperlen, mens filamentet opvarmes. Bryd kapillæren ved at slukke for opvarmningen og løsne den fra glasperlen i en position, hvor dens ydre diameter er 6 μm. Flyt kapillæren, så glasperlen placeres på et punkt ~1 mm fra kapillærspidsen uden kontakt. Varm glødetråden, så kapillæren kan bøje opad i en vinkel på 20°. Afmonter mikroinjektionspipetten fra mikroforge og opbevar den i en sikker kasse til senere brug.BEMÆRK: Mikroinjektionspipetterne fremstilles med følgende specifikationer: ydre diameter, 6 μm; indvendig diameter, 4,5-5 μm; bøje vinkel, 20°. At definere det optimale design af mikroinjection pipetten er vigtigt for succesen af den intracytoplasmiske injektion. For stor en indvendig diameter kan forhindre brud på plasmamembranen hos donor DKO-phESCs (se diskussionsafsnittet). Hvis den indre diameter er for smal, kan det hindre glat pipettering af donor DKO-phESCs. En bøjningsvinkel < 30° er at foretrække, da en høj bøjningsvinkel hæmmer effekten af piezoimpulser. 12. Intracytoplasmisk injektion af DKO-phaESCs Inden den intracytoplasmiske injektion (fra trin 12.2) fremstilles en polyvinylpyrrolidoneopløsning (PVP) ved at tilsætte 5 ml M2 medium i et 50 ml rør, der indeholder 0,6 g PVP, og røret omrøret på en vippe ved 4 °C i 2 dage. Når PVP er opløst fuldstændigt, filtreres opløsningen sterilt og opbevares ved 4 °C. På dagen for den intracytoplasmiske injektion skal du tilberede en center-well skål med 900 μL KSOM medium og forvarme skålen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Forbered en mikromanipulationsskål ved at justere dråber på 5 μL PVP-opløsning og 20 μL M2-medium på et låg på en 10 cm skål, der er placeret på hovedet. Dæk dråberne med mineralsk olie, og læg skålen på indsprøjtningens mikroskop.BEMÆRK: Det anbefalede arrangement af mikromanipulationsskålen er vist i figur 4B. Installer en holdepipette på mikromanipulatoren. Fyld mikroinjection pipetten med fluorocarbonolien ved hjælp af en mikrolæsserspids, og monter den på piezo aktuatoren. Nedsænk mikroinjektionspipetten i en dråbe med PVP-opløsning og pipette op og ned flere gange for at belægge glasset med PVP og gøre det mindre klæbrigt. Læg en lille mængde PVP-opløsning i mikroinjektionspipetten, og flyt pipetten til en dråbe med M2-medium. Fordyb holdepipetten i M2-mediet, og fokuser på pipetten i bunden af dråben. Der overføres ca. 2 μL DKO-phaESC-affjedring fra trin 10.6 til M2-mediumfaldet. Overfør 10 MII oocytter fra trin 8.5 til samme M2 medium drop ved hjælp af en mundpipette. Til injektion skal du rotere en oocyt i M2-mediumdråben, så perivitellinerummet vender mod mikroinjektionspipetten, og MII-pladen ikke er placeret i stien til mikroinjektionspipetten (Figur 4A). Hold oocytten ved at trykke negativt gennem holdepipetten.BEMÆRK: En MII-plade identificeres visuelt som et fremspring af ooplasmos, der kaldes en “pukkel” og ofte placeret ved siden af den første polære krop. MII-pladen indeholder den meiotiske spindel med tilhørende kromosomer. Berøring af mikroinjektionspipetten og MII-pladen skal undgås, da mekanisk skade på spindel og kromosomer kan forstyrre embryoudviklingen. Læg en DKO-phaESC i spidsen af mikroinjection pipetten ved at anvende blidt undertryk. Brud plasmamembranen i en DKO-phaESC ved pipetter for at undgå injektion af en intakt DKO-phaESC(Figur 3C; se diskussion).BEMÆRK: Hvis plasmamembranen i en DKO-phaESC ikke bristes ved pipettering, skal du kassere DKO-phaESC og indlæse en anden DKO-phaESC. Placer mikroinjection pipetten i kontakt med oocytens zona pellucida, og påfør en lille mængde undertryk i mikroinjection pipetten. Påfør piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) for at bryde gennem zonaen, mens du skubber spidsen af mikroinjektionspipetten mod perivitellinerummet. Bekræft, at MII-pladen, der indeholder en spindel og kromosomer, ikke er placeret i stien til mikroinjection pipetten.BEMÆRK: Empirisk justere indstillingen til de laveste piezo pulser til boring gennem zona for at minimere risikoen for skader på oolemma. Kassér fragmentet af zona pellucida fra mikroinjection pipetten, og placer DKO-phaESC på kanten af pipetten. Træng ind i oocytten med mikroinjection pipetten, så oolemmaen når den modsatte side.BEMÆRK: Rør ikke ved MII-pladen for at undgå skader på spindel og kromosomer. Påfør en piezo puls (intensitet, 6; frekvens, 1) for at gennembore oolemma. Sørg for, at oolemmaen slapper af langs mikroinjection pipettens aksel.BEMÆRK: Empirisk definere den laveste indstilling af piezo puls for at bryde oolemma at minimere skaderne på oocyt. DKO-phaESC injiceres med et minimalt mediumindhold i ooplasmen, og mikroinjektionspipetten trækkes jævnt ud af oocytten. Udløs den injicerede oocyt fra holdepipetten, og læg den på siden af mikrodråben til senere opsamling. Injektionsproceduren gentages fra trin 12.9 til 12.17 for de andre MII-oocytter i M2-mediumdråben.BEMÆRK: Undgå at holde oocytterne ude af inkubatoren i mere end 20 minutter. Det er vores erfaring, at et parti på 10 oocytter kan manipuleres komfortabelt inden for 15 minutter efter passende træning. Overfør partiet af injicerede oocytter fra M2 medium drop til en forvarmet center-well parabol med KSOM medium. Skålen opbevares i 1 time ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. Der gentages oocytmanipulationen fra trin 12.5 og 12.20 med yderligere grupper af MII-oocytter for at opnå nok injicerede oocytter. 13. Aktivering af konstruerede halvklonede embryoner Forbered to center-well retter med 900 μL hver af KSOM medium og aktivering medium. Forbered en 4-brønds plade med 700 μL KSOM medium i hver brønd. Forvarm opvasken og pladen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Efter 1 time i KSOM medium overføres de injicerede oocytter fra trin 12.21 til den forvarmede center-well skål med aktiveringsmedium. Skålen opbevares i 6 timer ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære til aktivering. Efter aktivering, observere nogle semi-klonede embryoner danner tre polære organer, som er den første og den anden polære organer oocyt, og pseudo polære krop fra DKO-phaESC (Figur 3E). Vask embryonerne 3 gange ved at overføre dem til nye brønde med KSOM medium i en 4-brønds plade. Overfør embryonerne til midterbrønden med KSOM-medium, og hold skålen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære for yderligere udvikling. 14. Udvikling af konstruerede halvklonede embryoner Efter 1 dags kultur i KSOM-mediet fra trin 13.6 når flere halvklonede embryoner 2-cellestadiet (Figur 5A). Til videreudvikling af præimplantationsembryoner in vitro fortsætte med at dyrke de halvklonede embryoner i KSOM-medium ved 37 °C i en 5% CO2-atmosfære. Overfør de halvklonede embryoner til frisk KSOM medium på dag 2. På dag 4 vil flere embryoner nå blastocyststadiet (Figur 5A). Til afledning af halvklonede mus overføres 2-cellede embryoner fra trin 14.1 til ovidukterne af pseudo-gravide recipienthunner. Identificer pseudo-gravide hunner ved at parre sig med vasektiserede hanner en dag før embryooverførslen og vælge dem på grundlag af tilstedeværelsen af et klart synligt stik om morgenen på dagen for embryooverførslen (0,5 dage efter coitum (dpc)). Omkring 19,5 dpc, fuld sigt hvalpe er naturligt leveret fra modtageren hunner (Figur 5B).