Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC’s) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.
Neovascularisatie wordt meestal geïnitialiseerd vanuit een bestaande normale vasculatuur en de biomechanische micromilieu van endotheelcellen (EC’s) in de beginfase varieert dramatisch van het volgende proces van neovascularisatie. Hoewel er tal van modellen zijn om verschillende stadia van neovascularisatie te simuleren, ontbreekt een in vitro 3D-model dat het initiële proces van neovascularisatie capituleert onder de overeenkomstige stimulaties van normale vasculatuurmicromilieus nog steeds. Hier hebben we een in vitro 3D-model gereconstrueerd dat de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) nabootst. Het MIEN-model bevat een microfluïdische kiemchip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem. Een functionele, perfuseerbare microkanaal bedekt met endotheel werd gevormd en het proces van ontkiemen werd gesimuleerd in de microfluïdische kiemchip. De aanvankelijk fysiologische micromilieu van neovascularisatie werd samengevat met het microfluïdische controlesysteem, waardoor EC’s tegelijkertijd zouden worden blootgesteld aan hoge luminale schuifspanning, fysiologische transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactorverdelingen (VEGF). Het MIEN-model kan gemakkelijk worden toegepast op de studie van het neovascularisatiemechanisme en heeft een potentiële belofte als een goedkoop platform voor geneesmiddelenscreening en toxicologische toepassingen.
Neovascularisatie vindt plaats in veel normale en pathologische processen1,2,3,4, waaronder twee belangrijke processen bij volwassenen, angiogenese en arteriogenese5. Naast de bekendste groeifactoren, zoals vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)6, zijn mechanische stimulaties, met name de door de bloedstroom veroorzaakte afschuifstress, belangrijk bij de regulatie van neovascularisatie7. Zoals we weten, variëren de omvang en vormen van schuifspanning dramatisch en dynamisch in verschillende delen van de vasculatuur, wat resulteert in belangrijke effecten op vasculaire cellen8,9,10,11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat schuifspanning verschillende aspecten van EC’s kan beïnvloeden, waaronder celfenotypische veranderingen, signaaltransductie, genexpressie en de communicatie met muurschilderingcellen13,14,15,16,17,18,19,20; dus, reguleren neovascularisatie21,22,23,24.
Daarom, om neovascularisatie beter te begrijpen, is het belangrijk om het proces in natuurlijke cellulaire micromilieu in vitrote reconstrueren. Onlangs zijn er veel modellen opgericht om microvaten te creëren en nauwkeurige controle te bieden over micromilieu25,26,27,gebruikmakend van de vooruitgang in microfabrication en microfluïdische technologie. In deze modellen kunnen microvaten worden gegenereerd door hydrogel28,29, polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische chips30,31,32 of 3D bioprinting33,34. Enkele aspecten van het micromilieu, zoals luminale schuifspanning22,23,35,36, transendotheelstroom37,38,39,40, biochemische gradiënt van angiogenefactoren 41,42, stam/rek43,44,45, en samen met andere typen cellen32,46 zijn nagebootst en gecontroleerd. Meestal werd een groot reservoir of spuitpomp gebruikt om doordrenkt medium te bieden. De transendotheelstroom in deze modellen werd gecreëerd door drukval tussen het reservoir en microbuis22,23,38,40. Het mechanische micromilieu was echter moeilijk constant op deze manier te onderhouden. De transendotheliale stroom zou toenemen en dan het fysiologische niveau overschrijden als een hoog debiet met hoge schuifspanning voor perfusie werd gebruikt. Eerdere studie toonde aan dat in de beginperiode van neovascularisatie de snelheid van de transendotheelstroom zeer laag is als gevolg van de intacte EC’s en keldermembraan, meestal minder dan 0,05 μm/s8. Ondertussen, hoewel luminale schuifspanning in vasculair systeem sterk varieert, is het relatief hoog met gemiddelde waarden van 5-20 dyn/cm2,11,47. Voorlopig is de snelheid van de transendotheelstroom in eerdere werken over het algemeen tussen 0,5-15 μm/s22,38,39,40gehouden en was de luminale schuifspanning meestal minder dan 10 dyn/cm223. Het blijft een moeilijk onderwerp om EC’s voortdurend bloot te stellen aan hoge luminale schuifspanning en fysiologisch niveau van transendotheelstroom tegelijkertijd.
In deze studie beschrijven we een in vitro 3D-model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) na te bootsen. We ontwikkelden een microfluïdische chip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem om perfusiemicrobuizen te vormen en het proces van ontkiemen48te simuleren. Met het MIEN-model wordt de micromilieu van EC’s die tijdens de eerste periode van neovascularisatie worden gestimuleerd, eerst samengevat. EC’s kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheelstroom en verschillende VEGF-distributie tegelijkertijd. We beschrijven de stappen om het MIEN-model in detail vast te stellen en de belangrijkste aandachtspunten, in de hoop een referentie te bieden aan andere onderzoekers.
Lange tijd was real-time observatie van neovascularisatie een probleem. Onlangs zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om doordrenkte vaten te creëren die bekleden met EC’s en grenzend aan de extracellulaire matrix voor het ontkiemen van22,32,40 ,46,54, maar het mechanische micromilieu is nog steeds moeilijk constant te onderhouden. Het blijft een moeilij…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 en 32071311), Nationaal belangrijk onderzoek- en ontwikkelingsprogramma van China (subsidienr. 2016YFC1101101 en 2016YFC1102202), het 111 Project (B13003) en de Beijing Natural Science Foundation (4194079).
0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
Image editing software | PhotoShop | NA | |
Image processing program | ImageJ | NA | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
Program software | MATLAB | NA | |
Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
SU-8 developer | Microchem | NA | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |