JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC’ ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Abstract

Neovaskülarizasyon genellikle mevcut normal bir vaskülatörden başlatılır ve ilk aşamada endotel hücrelerinin (VC) biyomekanik mikroçevrasyonu aşağıdaki neovaskülarizasyon sürecinden önemli ölçüde değişir. Neovaskülarizasyonun farklı aşamalarını simüle etmek için birçok model olmasına rağmen, normal vaskülür mikroçevronmentlerinin karşılık gelen stimülasyonları altında neovaskülarizasyonun ilk sürecini teslim eden bir in vitro 3D model hala eksiktir. Burada, neovaskülarizasyonun (MIEN) ilk olayını taklit eden bir in vitro 3D modeli yeniden inşa ettik. MIEN modeli bir mikroakışkan filizlenen çip ve otomatik kontrol, yüksek verimli sirkülasyon sistemi içerir. Endotel ile kaplanmış fonksiyonel, perf kullanılabilir bir mikrokanal oluştu ve mikroakışkan filizlenme çipinde filizlenme süreci simüle edildi. Neovaskülarizasyonun başlangıçtaki fizyolojik mikroçevresi, VC’lerin aynı anda yüksek ışıklı kesme stresine, fizyolojik transendotelyal akışa ve çeşitli vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) dağılımlarına maruz kalacağı mikroakışkan kontrol sistemi ile yeniden düzenlendi. MIEN modeli, neovaskülarizasyon mekanizmasının çalışmasına kolayca uygulanabilir ve ilaç taraması ve toksikoloji uygulamaları için düşük maliyetli bir platform olarak potansiyel bir vaatte bulunmaktadır.

Introduction

Neovaskülarizasyon, yetişkinlerde anjiogenez ve arteriogenez 5 olmak üzere iki ana süreci içeren birçok normal ve patolojik süreç1,2,3,4‘te gerçekleşir. Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF)6gibi en iyi bilinen büyüme faktörlerinin yanı sıra, mekanik stimülasyonlar, özellikle kan akışı kaynaklı kesme stresi, neovaskülarizasyonun düzenlenmesinde önemlidir7. Bildiğimiz gibi, kesme stresinin büyüklüğü ve formları vaskülarürün farklı bölgelerinde önemli ölçüde ve dinamik olarak değişir ve vasküler hücreler üzerinde önemli etkilere neden olan 8,9,10,11,12. Önceki çalışmalar, kesme stresinin hücre fenotipik değişiklikler, sinyal transdüksiyon, gen ekspresyasyonu ve duvar hücreleri 13 , 14 , 15 , 16,17,18,19,20ile iletişim dahil olmak üzere VC’lerin çeşitli yönlerini etkileyebileceğini göstermiştir; bu nedenle, neovaskülarizasyonu düzenleyin21,22,23,24.

Bu nedenle, neovaskülarizasyonu daha iyi anlamak için, süreci doğal hücresel mikroçevrici in vitro olarakyeniden oluşturmak önemlidir. Son zamanlarda, mikro gıda ve mikroakışkan teknolojideki gelişmelerden yararlanarak mikro damarlar oluşturmak ve mikroçevre25,26,27’ninhassas kontrolünü sağlamak için birçok model kurulmuştur. Bu modellerde, mikro damarlar hidrojel28 , 29,polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan çipler30 , 31,32 veya 3D biyobaskı33,34ile üretilebilir. Işıklı kesme stresi22 , 23,35 , 36,transendotelial akış37,38,39,40, biyokimyasal gibi mikroçevrenin bazı yönleri anjiyojenik faktörlerin gradyani41,42, gerinim / streç43,44,45ve diğer hücre türleriyle birlikte kültürlenmiş32,46 taklit edilmiş ve kontrol edilmiştir. Genellikle, perfüzyonlu ortam sağlamak için büyük bir rezervuar veya şırınna pompası kullanılmıştır. Bu modellerde transendotelial akış rezervuar ve mikro tüp arasındaki basınç düşüşü ile oluşturulmuştur22,23,38,40. Bununla birlikte, mekanik mikroçevretmenin bu şekilde sürekli olarak sürdürülmesi zordu. Perfüzyon için yüksek kesme stresi olan yüksek bir akış hızı kullanılırsa transendotelial akış artacak ve daha sonra fizyolojik seviyeyi aşacaktı. Önceki çalışma, neovaskülarizasyonun ilk döneminde, genellikle 0.05 μm / s8’inaltında, bozulmamış WC’ler ve bodrum membran nedeniyle transendotelial akış hızının çok düşük olduğunu göstermiştir. Bu arada, vasküler sistemde parlak kesme stresi büyük ölçüde değişmekle birlikte, 5-20 dyn /cm 2,11,47ortalama değerleri ile nispeten yüksektir. Şimdilik, önceki çalışmalarda transendotelyal akışın hızı genellikle 0,5-15 μm /s22,38,39,40arasında tutulmuştur ve ışık kesme stresi genellikle 10 dyn/cm2 23’ünaltındadır. VC’leri sürekli olarak yüksek ışık yarıçapı stresine ve fizyolojik transendotelyal akış seviyesine aynı anda maruz bırakmak zor bir konu olmaya devam etmektedir. 

Bu çalışmada, neovaskülarizasyonun (MIEN) ilk olayını taklit etmek için bir in vitro 3D modeli tarif ediyoruz. Perfüzyon mikro tüpleri oluşturmak ve filizlenme sürecini simüle etmek için bir mikroakışkan çip ve otomatik kontrol, yüksek verimli sirkülasyon sistemigeliştirdik. MIEN modeli ile, neovaskülarizasyonun ilk döneminde uyarılan EC’lerin mikroçevrimi öncelikle yeniden kapsüllenir. WC’ler yüksek ışıklı kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve aynı anda çeşitli VEGF dağılımı ile uyarılabilir. MIEN modelini oluşturma adımlarını ve dikkat edilmesi gereken önemli noktaları ayrıntılı olarak açıklıyoruz, diğer araştırmacılar için bir referans sağlamayı umuyoruz.

Protocol

1. Gofret hazırlığı NOT: Bu protokol, bu araştırma sırasında kullanılan SU-8 2075 negatif fotoresist için özeldir. Silikon gofreti bir spin kaplayıcı üzerinde metanol ve izopropanol ile 3 ila 5 kez temizleyin: önce 500 rpm’de 15 s için spin ve ardından 3.000 rpm’de 60 s için döndürün. Silikon gofreti önceden 180 °C’ye ısıtılmış bir ocaklara aktarın ve gofreti 10 dakika pişirin. Silikon gofretleri ocaktan çıkarın ve oda sıcaklığ?…

Representative Results

Burada sunulan ilk neovaskülarizasyon (MIEN) olayını taklit eden in vitro 3D model, mikroakışkan filizlenen bir çip ve bir mikroakışkan kontrol sisteminden oluşuyordu. Mikroakışkan filizlenen çip önceki yayınlardan optimizeedilmiştir 22,23,37,40,51,52,53. Kısaca, ü?…

Discussion

Uzun zamandır, neovaskülarizasyonun gerçek zamanlı gözlemi bir sorun olmuştur. Son zamanlarda 22 ,32,40 ,46,54filizlenmesi için WC’lerle ve hücre dışı matrise bitişik perfüzyonlu kaplar oluşturmak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, ancak mekanik mikroçevrimini sürekli olarak sürdürmek hala zordur. Yüksek ışıklı kesme stres…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Araştırma Vakfı Yardım Hibeleri tarafından desteklendi (hibe no. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 ve 32071311), Çin Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı (hibe no. 2016YFC11010101 ve 2016YFC1102202), 111 Projesi (B13003) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (4194079).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial “vessels” for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Keywords: Microfluidic ModelNeovascularizationAngiogenesisEndothelial CellsVascular Endothelial Growth FactorHydrogelShear StressCell CultureFibronectinMicrofluidic Control SystemPerfusionSprouting
check_url/pt/62003?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image