Målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning om prøveprepareringen ved planlegging av eksperimenter ved hjelp av MALDI MSI for å maksimere metabolsk og molekylær deteksjon i biologiske prøver.
Metabolomics, studien for å identifisere og kvantifisere små molekyler og metabolitter tilstede i en eksperimentell prøve, har dukket opp som et viktig verktøy for å undersøke de biologiske aktivitetene under utvikling og sykdommer. Metabolomics tilnærminger er mye brukt i studiet av kreft, ernæring / kosthold, diabetes, og andre fysiologiske og patologiske forhold som involverer metabolske prosesser. Et fordelaktig verktøy som hjelper til med metabolomisk profilering som er fremmet i dette dokumentet, er matriseassistert laseravledning / ionisering massespektrometriavbildning (MALDI MSI). Dens evne til å oppdage metabolitter in situ uten merking, strukturelle modifikasjoner eller andre spesialiserte reagenser, for eksempel de som brukes i immunostaining, gjør MALDI MSI til et unikt verktøy for å fremme metoder som er relevante innen metabolomics. En passende prøveforberedelsesprosess er avgjørende for å gi optimale resultater og vil være fokus for dette papiret.
Metabolitter, mellomprodukter eller sluttprodukter av metabolisme, inkludert nukleotider, aminosyrer eller organiske syrer, lipider, er viktige komponenter til biologiske funksjoner og prosesser. Metabolomics, studiet av metabolitter, muliggjør utforskning av deres biokjemiske interaksjoner og forståelsen av deres roller i sammenheng med grunnleggende, translasjonell og klinisk forskning. Metabolitter er sterkt forbundet med fenotyper av organismer og gir informasjon om biokjemiske aktiviteter som oppstår under cellulær metabolisme1. Derfor, i tillegg til genomikk og proteomikk, metabolomics har dukket opp som et viktig verktøy for å forstå både fysiologiske og patologiske forhold. For eksempel brukes metabolomics til å belyse mekanismene bak eksisterende stoffer så vel som deres toleranse. I narkotikautvikling er xenobiotisk metabolisme nyttig for å vurdere aktiviteten eller toksisiteten til metabolitter på tvers av arter, som senere oversettes til å støtte personlig medisin2. Til tross for den brede anvendelsen av metabolomics, kan avbildning av metabolitter være utfordrende på grunn av metabolitters kjemiske reaktivitet, strukturell heterogenitet og bredt konsentrasjonsområde3. Imidlertid kan konsentrasjonene av labile metabolitter, inkludert høyenergiforbindelser, glukose, laktat, glykolytisk, pentose shuntbane og TCA-syklus mellomprodukter, fosfolipider, nevrotransmittere, signalforbindelser, endres i løpet av sekunder og fremgang over minutter når vevsenzymer er aktive under vevshøstingsprosedyrer, for eksempel postmortem ischemia i hjernehøsting4,5,6 , . For å sikre nøyaktig datainnsamling av metabolomics er passende og nøye prøvepreparering kritisk7,8. Nåværende etablerte plattformer for måling av metabolitter inkluderer NMR, enzymanalyser og massespektrometri (inkludert væske- og gasskromatografi), hvorav den siste er diskutert lenger nedenfor.
MALDI-MSI er en toppmoderne teknikk som muliggjør analyse av komplekse prøver gjennom påvisning av individuelle molekylære arter. MALDI MSI gir fordelen av å kunne raskt og reprodusere ulike molekylære forbindelser i biologiske prøver. Massespektrometriavbildning muliggjør videre produksjon av bilder som representerer vevsbiologi basert på komposittmetabolitter, og gjør det samtidig som den romlige fordelingen av metabolittene iprøven 9. MALDs evne til å oppdage analytter i en prøve uten bruk av antistoffmerking, strukturelle modifikasjoner eller andre spesialiserte reagenser, for eksempel de som brukes i immunostaining, kombinert med sin evne til å overvåke hundrevis av molekyler i et enkelt eksperiment, utgjør bare noen få av fordelene MS-bildestipender når det gjelder metabolsk profilering10, 11. I tillegg til ofte brukte matriser som 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) og 9-aminoacridine (9-AA), nylig oppdaget ny matrise N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC), som er godt egnet for analyser av ulike lavmolekylære metabolitter, har ytterligere forbedret anvendelsen av MALDI MSI i metabolsk profilering1 .
Til tross for den brede anvendelsen av MALDI MSI, forhindrer den høye prisen på instrumentet og kompleksiteten i den eksperimentelle prosedyren dens bredere implementering i individuelle forskningslaboratorier. Derfor støttes de fleste av MALDI MSI-studiene gjennom felles kjernefasiliteter. Prøveprepareringen, inkludert lysbildeforberedelse og matrisebelegg, er det mest kritiske trinnet i MALDI MSI. Imidlertid utføres lysbildeforberedelsene normalt i den enkelte forskers laboratorium, noe som skaper potensielle variasjoner i senere MALDI MSI-oppkjøp. Her tar vi sikte på å gi en detaljert protokoll for prøvepreparering av biologiske prøver før vi går videre til MALDI MSI-målinger, og bruker en metabolomisk profilering av utviklingsmushjerne som eksempel.
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) er en etikettfri bildeteknikk som gjør det mulig for forskere å undersøke fordelingen av ulike biomolekyler og deres modifikasjoner i vev, det molekylære grunnlaget for patologi. Kombinert bruk av MALDI-MSI med tradisjonelle LC-MS-tilnærminger for vevsanalyse gir samme molekylære dybde som tradisjonelle Omics-arbeidsflyter, men som også beholder det romlige forholdet mellom disse signalene i mobilnettverket. Prøveprepareringen er det mest kritiske trinnet i MALDI MSI og står for variasjonen i de endelige opplesningene av metabolomikkstudier utført i forskjellige laboratorier4. Her tilbyr vi en omfattende, men praktisk protokoll for å standardisere prøveforberedelsene for metabolomisk profilering ved hjelp av MALDI MSI, i håp om at det gagner et bredt forskningsmiljø å implementere MALDI MSI i sin nåværende og fremtidige forskning fra grunnleggende biologi til translasjonsstudier.
Man må alltid huske på alle forholdsregler for å minimere endringer i molekylære profiler (både overflod og romlig distribusjon) under prøvepreparater og unngå forurensning. For det første, minimere tiden mellom animalsk eutanasi og vevshøsting, for eksempel frossen in situ eller oppvarmet ved mikrobølgefiksering for å inaktivere enzymer i hjernen for å redusere ansvaret for postmortem iskemi4,5,6. For det andre er snap-frysetilstanden til prøven kritisk. Utilstrekkelig frysing vil føre til nedbrytning og tap av metabolittene, mens over frysing vil føre til vevsfragmentering under kryooseksjon. Frysetiden bør alltid testes først i henhold til tidligere rapporterte studier, og studien av utviklingsmushjerne presentert i dette dokumentet gir referansepunktene for gnagerhjernevev. For det tredje vil kutting av biologisk vev og overføring av seksjonene til ITO-lysbildene kreve tilstrekkelig praksis. Det er viktig å merke seg at når du bruker børsten til å hente delen fra scenen, bør børsten brukes delikat. La børstehårene bare komme i kontakt med kantene på vevsdelen for å redusere risikoen for forurensning og seksjonsfragmentering. Flat delen på lysbildet så mye som mulig, dette vil forhindre krølling av delen under fingeroppvarming. For det fjerde, mens du monterer på ITO-lysbildet, må du sørge for at hele delen er godt festet til ITO-lysbildet, da forskjellige områder av vevet kan kreve forskjellig tid for fingeroppvarming. For eksempel krever hjernesvulstvev lengre oppvarmingstid enn normalt hjernevev. En dårlig montering kan føre til løsrivelse og fragmentering av vevet under MALDI-MS-skanning. Husk at fingeroppvarming kan muliggjøre enzymvirkning og metabolisme som forårsaker artefaktuelle endringer av metabolitter. For det femte spiller en fin og ensartet avsetning av MALDI-matrise en viktig rolle i å oppnå nøyaktig romlig informasjon og sterkt MALDI-MS-signal. Det anbefales å teste matrisesprøytingen på et tomt lysbilde, og observere krystallmønsteret under et mikroskop for å verifisere riktig dekning, før du fortsetter til belegget av dyrebar prøvesklie. Og til slutt, siden en individuell forsker utfører vevshøsting og glideforberedelse i forskjellige hastigheter, ville det være ideelt å ha en person til å håndtere prøvepreparatet for prøven i samme kohort, for å minimere variasjonen.
Protokollen ovenfor beskriver standardprosedyrer, som kan skreddersys mot behovene til bestemte eksperimenter. For eksempel kan en kryo-seksjoneringsgel OCT, som vanligvis brukes i kryo-seksjonering av prøven, videre brukes som monteringslim til vevschucken (som i studien beskrevet ovenfor). Tidligere studier har vist at polymerkomponenten i OCT forårsaker sterk ionundertrykkelse14. Imidlertid kan innebygging av prøven være uunngåelig i tilfeller der vevet er for skjøre til å bli kuttet uten ekstra støtte fra en polymergel. For å bekjempe signalundertrykking i disse tilfellene, kan vevet måtte vaskes med seriell vask i 70% etanol og 95% etanol for å fjerne gjenværende OCT for påvisning av proteiner eller lipider, mens vaskingen ikke anbefales for påvisning av små molekylære metabolitter9.
MALDI MSI har blitt stadig mer relevant i både forskningslaboratoriet og klinisk praksis. For eksempel har MALDI MSI nylig vist seg nyttig i studier av proteomikk for å karakterisere fenotypisk funksjonell status for en organisme15, og i å fungere som et middel for mikrobiell identifikasjon og diagnose av etterfølgende sykdom16. Mens MALDI MSI støtter et bredt spekter av applikasjoner, er det noen begrensninger forbundet med å stole utelukkende på denne teknikken, spesielt når det gjelder å skille mellom lignende arter eller metabolitter, og identifisering av spesifikke mål. En annen utfordring er kvantifiseringen av metabolittenes konsentrasjon i henhold til MALDI MSI-signaler. Det antas ofte at ionoverflod i MALDI MSI-spektra og romlig fordeling (eller relative overflod) av tilsvarende molekylære arter på tvers av dissekert vev er godt korrelert. Imidlertid bør man alltid huske på at forholdet mellom ionintensitet og mengden av tilsvarende molekylære arter er komplisert av mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, effekter av ionundertrykking, endringer i vevsstruktur og ionmolekylreaksjoner17. Teknikker som benytter seg av interne standarder kan implementeres for absolutt kvantifisering (μmol/g vev) i Maldiv-MSI18. Disse to utfordringene løses vanligvis med den kombinerte arbeidsflyten til MALDI MSI med flytende kromatografi tandem MS(LC-MS/MS)-teknikker, der MALDI-MS tillater kartlegging av interesseområdet, som senere blir utsatt for mikroekstraksjon og LC-MS/MS for å gi mer informasjon for å identifisere metabolitten19.
MS-baserte avbildningsmetoder har blitt utviklet de siste årene som en alternativ modalitet til tidligere teknikker for avbildning av små molekylmetabolitter. Med fremskrittene og den økende populariteten til MALDI MSI, forventes det at Maldives avbildning vil bli et nytt standardverktøy for visualisering av små molekyler. Avbildning av lipid og endogene små molekyler (f.eks. nevrotransmittere og metabolitter) i den biologiske konteksten, samt avbildning av xenobiotika for utvikling av nye farmasøytiske midler er av spesiell interesse. Disse tre områdene forventes å ha raske fremskritt med anvendelse av MALDI MSI i nær fremtid20.
The authors have nothing to disclose.
Ye He og Rinat Abzalimov støttes av Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen og Kelly Veerasammy støttes av Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |