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Pesquisa do Câncer

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

Published: April 23, 2021
doi:
10.3791/62009
, , , , , ,
1Department of Surgery,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation,Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering,Louisiana State University, 5Department of Medicine,Tulane University School of Medicine

Summary

このプロトコルは、貯蔵材料を使った原発性ヒト乳房組織を用いて乳癌を研究するためのインビトロ微小生理学的システムの構築を記述する。

Abstract

乳癌(BC)は依然として女性の主要な死因である。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験に失敗しています。したがって、病気の理解を深めるために新しいモデルが必要です。NIHの微生理学的システム(MPS)プログラムは、基礎科学の発見の臨床翻訳を改善し、新しい治療戦略を有望にするために開発されました。ここでは、乳癌(BC-MPS)のMPSを生成する方法を提示する。このモデルは、脂肪由来幹細胞シート(ASC)sの間にWATを挟み込み、ヒト一次脂肪組織(WAT)を培養するという先に説明したアプローチを適応させる。BC-MPSの新しい側面には、BC細胞を非疾患ヒト乳房組織(HBT)に播種し、天然の細胞外マトリックス、成熟した腺細胞、常駐線維芽細胞、免疫細胞を含む。HBT由来ASCシート間でBC-HBT混和剤を挟み込む。得られたBC-MPSは、少なくとも14日間の培養ex vivoにおいて安定である。このモデルシステムは、アディポサイト、間質細胞、免疫細胞、および細胞外マトリックスを含むBCに影響を与える微小環境の複数の要素を含む。したがって、BC-MPSは、BCとその微小環境との相互作用を研究するために使用することができる。

我々は、癌の進行と転移に影響を及ぼすと知られている2つのBC行動を研究することによって、BC-MPSの利点を実証する:1)BC運動性および2)BC-HBT代謝クロストーク。BC運動は以前、生体内イメージングを用いて実証されていましたが、BC-MPSでは数日間にわたって蛍光顕微鏡を用いた高分解能のタイムラプスイメージングが可能です。さらに、代謝クロストークは、BC細胞と未熟なアディポサイトに分化したマウス前アディポサイトを使用して以前に実証されましたが、BC-MPSモデルは、初代ヒト乳腺細胞とBC細胞の間でこのクロストークを実証した最初のシステムです。

Introduction

毎年、40,000人以上の米国の女性が乳癌(BC)1で死亡しています。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験2,3に失敗しています。医薬品開発パイプラインとBCの理解を深めるためには、新しいモデルが必要です。NIHマイクロ生理学(MPS)プログラムは、基礎科学を臨床成功に翻訳するための画期的なモデルに必要な機能を説明しました 4.これらには、ヒトの原発性細胞または組織の使用、4週間の培養における安定、およびネイティブ組織アーキテクチャおよび生理学的応答の包含が含まれていた。

BC細胞株の2次元培養、膜挿入共培養、三次元スフェロイドおよびオルガノイドなどの現在のインビトロBCモデルは、いずれも在来乳房組織アーキテクチャを再現しないため、NIHのMPS基準を満たしていない。細胞外マトリックス(ECM)がこれらのシステムに添加されると、乳房ECMは使用されません。代わりに、コラーゲンゲルと原膜マトリックスが使用されます。

患者由来異種移植片(PDX)などの生体外システムの電流は、同様に、マウス乳腺組織がヒトの乳房と大きく異なるため、NIHのMPS基準を満たしていない。さらに、免疫系とBCの相互作用は腫瘍の発症の鍵としてますます認識されているが、PDX腫瘍を発生させる免疫不全マウスモデルは成熟したT細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を欠いている。さらに、PDXは原発性乳房腫瘍を維持および拡張することを可能にするが、得られたPDX腫瘍は原発性マウス間質細胞およびECM5とに浸潤される。

これらの課題を克服するために、我々はNIH MPS基準を満たす新しい、ex vivo、3次元の人間の乳房MPSを開発しました。私たちの乳房MPSの基礎は、脂肪由来幹細胞(ASC)の2枚のシートの間に原発性ヒト乳房組織(HBT)を挟み込み、HBTからも分離することによって作られる(図1)。HBTを挟むためにセルシートを移すプランジャーは、3Dプリントまたはシンプルなアクリルプラスチックから作ることができます(図1H、I)。この技術は、原発性ヒト白色椎細胞組織6,7を培養するための先に述べたアプローチを適応させる。乳房MPSは、標準的なBC細胞株から原発性ヒト乳房腫瘍に至るまで、選択したBCモデルによって播種することができる。ここでは、これらのBC-MPSが数週間培養中安定していることを示します(図2)。乳腺腺細胞、ECM、内皮、免疫細胞などのHBTのネイティブ要素が含まれます (図 3);代謝クロストークなどのBCとHBTの生理学的相互作用を再現する(図4)。最後に、BC-MPSがHBT全体のBC細胞のアメーバ運動の研究を可能にすることを示す(図5)。

Protocol

すべてのヒト組織は、LSUHSCの機関審査委員会事務所によって承認されたプロトコル#9189に従って収集された。 1. 脂肪由来幹細胞(ASC)の細胞シートの播種 商業ソースからASCを購入するか、確立されたプロトコル8、9に従うことによって、原発性ヒト乳房組織から分離する。人間の乳房ASCを70%密度(約80,000細胞/cm2表面…

Representative Results

培養の安定性BC-MPSは、少なくとも14日間インビトロで培養することができる安定した微生理学的システムである。ASC細胞シートの明視野画像を100倍倍で撮影し、コンフルエントシートの線状パターンを表示した(図2A)。ASC細胞シートは、少なくとも4週間培養において安定である。6ウェルプレートの1ウェルで培養した14日でのBC-MPS?…

Discussion

ヒト乳癌をモデル化するための新しいシステムは、この疾患のより良い理解を開発するために必要とされる。ネイティブECMおよび間質細胞を含む疾患設定をモデル化するヒト微小生理学的システムの開発は、前臨床試験の予測力を高める。ここで示すBC-MPSモデルは、以前のモデルの限界を克服し、ネイティブHBT環境でのBCの評価を可能にする新開発のシステムです。このシステムは癌細胞株?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、トゥレーンフローサイトメトリーとセルソートコアだけでなく、彼らの技術サポートのためのトゥレーン神学コアに感謝したいと思います。この研究は、南東部プラスチック再建外科医協会2019研究助成金と国立科学財団(EPSCoRトラック2 RII、OIA 1632854)によって支援されました。

Materials

Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter
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Referências

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Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).
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