我们描述了一个将人类皮肤衍生的成纤维细胞重新编程为诱导神经元祖先细胞(iNPC)的协议,以及它们随后分化成诱导的星形细胞(iAs)的协议。这种方法可快速、可重复地大量生成 iNC 和 iAs。
神经系统疾病的研究主要侧重于神经元对疾病机制的影响。动物模型的有限可用性严重影响了细胞类型对疾病特定贡献的研究。此外,动物模型通常不能反映人类患者的突变和疾病过程的变异性。诱导多能干细胞(iPSC)的再编程方法彻底改变了患者的特定研究,为研究疾病机制创造了宝贵的工具。然而,iPSC技术有缺点,如时间,劳动承诺,克隆选择性和表观遗传标记的损失。最近对这些方法的修改允许更直接地生成细胞系或特定细胞类型,绕过克隆隔离或多能干细胞状态。我们开发了一种快速直接转换方法,利用逆转录病毒载体与神经介质相结合,从皮肤成纤维细胞中产生诱导神经元祖细胞(iNPC)。iNPC可以区分成神经元(iNs)寡头细胞(iOs)和星形细胞(iAs)。iAs 生产有助于快速药物和疾病机制测试,因为与 iNC 的区分只需 5 天。此外,iAs 易于处理,并且大量在纯人群中生成。我们开发了一种高度可重复的共培养检测方法,使用小鼠 GFP® 神经元和患者衍生的 iAs 来评估许多神经和神经退行性疾病的潜在治疗策略。重要的是,iA 检测可扩展至 384 井格式,便于对一个板中的多个小分子进行评估。这种方法允许同时对具有不同遗传背景的多个患者细胞系进行治疗性评估。易于生产和储存 iAs,并能够在一次检测中筛选多种化合物,使这种方法适合个性化医学。
了解潜在的疾病机制对神经系统疾病至关重要,因为它有助于制定潜在的治疗策略。虽然动物模型历来是研究神经系统疾病的黄金标准,但将潜在疗法直接转化为临床环境往往显示出有限的成功1、2、3。缺乏翻译的原因是小鼠遗传背景和突变缺乏变异性,疾病表型显示不完整,药物敏感性变化或人类患者的服用在近亲繁殖小鼠菌株中表现不佳。此外,对于许多罕见的神经系统疾病,没有或很少的动物模型可用。直接研究相关人类细胞类型的疾病机制可以促进研究,并改善对临床的翻译。对于CNS疾病,原发性人类细胞很难检索,并且代表非常有限的来源,因为活检是侵入性的,或者只能在疾病的末期进行验尸。在过去的15年里,细胞重新编程技术的发展迅速扩展了在体外模拟人类神经和神经退行性疾病的能力。
传统的细胞重新编程方法包括将成纤维细胞或其他细胞类型重新编程成诱导多能干细胞(iPSC),能够从所有三个细菌层4中区分成细胞类型。高桥和山中是第一个表明,四个干细胞转录因子的再表达足以重定向体细胞成为iPSC5。然后,iPSC 可以进一步区分为特定的细胞类型。然而,这个过程的缺点是,产生和分离稳定的干细胞克隆是劳动密集型的,耗时。干细胞克隆中还保留着体细胞突变或母细胞的特定异常,并可能影响研究结果。此外,越来越多的证据表明,干细胞的重新编程过程会抹去可能影响细胞疾病机制的有价值的表观遗传变化。近年来,研究人员专注于修改的重新编程方法,允许更直接地生成不同的细胞类型,同时绕过多能干细胞状态9,10,11,12(审查在13,14)。 初步突破揭示在体外组合重新编程成纤维细胞到心肌细胞15,神经元16和肝细胞17通过异位表达的多个血统特定转录因子或微RNA18。随后进行了直接重新编程细胞以模拟神经紊乱19,20的研究。如上所述,这种直接重新编程或转换协议比经典的 iPSC 协议具有潜在的优势,包括速度和克隆隔离步骤的消融。此外,有证据表明,这些协议允许保持更多的表观遗传信息与病人的年龄,并可能同样适用于疾病相关标记7,8。
迄今为止,大多数关于神经系统疾病的体外研究主要集中在神经元上。然而,众所周知,其他细胞类型,如星形细胞, 微胶质和寡头细胞在疾病病理学和神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症)、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS)、帕金森病 (PD)、亨廷顿舞蹈症 (HD)、多发性硬化症 (MS) 和其他神经病理学(如雷特综合征 (RTT)、睡眠障碍、成瘾、 癫痫,溶酶体储存障碍,抑郁症,偏头痛和病理疼痛21,22,23,24,25,26。天体细胞是中枢神经系统(CNS)中最丰富的细胞类型,直到最近,它们从病理学角度被广泛忽视。众所周知,它们现在在支持健康 CNS 的几乎所有家居功能方面起着至关重要的作用。此外,很明显,它们具有重要的病理影响,在了解疾病机制和评估治疗策略方面非常有价值。
在目前的描述中,我们详细说明了人类患者成纤维细胞直接转化为诱导神经元祖细胞(iNPC)的协议,使用逆转录病毒载体表达山中再编程因子(Klf4,10月3/4,Sox2和c-Myc),以及随后接触神经化介质。先前的研究已经使用不同的转录因子组合直接重新编程到神经细胞(在14审查),但所述协议中使用的因素广泛可用,无论是作为质粒在内部生产的病毒载体,或作为商业上可用准备去病毒重新编程套件。由此产生的iNPC可以进一步区分成诱导神经元(iNs)27,寡头细胞(iOs)24和星形细胞(iAS)19,以研究它们在神经系统疾病中的作用。我们的协议不涉及耗时的iPSC生成,大多数可用的协议用于人类星形细胞28的衍生。大约98%至100%的直接重新编程的iNPC可以区分成GFAP阳性星形细胞29,而只有2%使用直接转换方法从成纤维细胞到星形细胞30。最近,一项使用我们描述的再编程方法进行的比较转录研究表明,从供体成纤维细胞重新编程的iNPC可以在转录和功能水平上保留与死后天体细胞和原生星细胞29相匹配的年龄特征。因此,这种转化协议是研究疾病机制和评估与年龄相关的神经退行性疾病和神经紊乱的新疗法的有力工具。
在这里,我们描述了用于生成 iNPC 和进一步区分为 iAs 的协议,这是最适合更大规模小分子筛选检测的。疾病机制和药物测试与iAs可以使用不同的方法,如与神经元共同培养或代谢和生化分析。与 iPSC 相比,该系统的优点是这些细胞系的维护速度和易于维护。此外,iNPC 可以冷冻在小部分 iAs 分化,从而在长期不变条件下进行药物测试。总体而言,通过这种方式,对较大的样本数量进行比较是可能的,这为评估更大、更具代表性的患者群体中化合物的治疗潜力打开了大门。
总之,直接转化是一种快速而简单的方法,从患者皮肤成纤维细胞中产生诱导神经元祖细胞。这种方法是有利的,因为它的速度以及大量的细胞生成,易于维护。此外,越来越多的证据表明,与经典的iPSC重新编程技术相比,直接重新编程方法去除的表观遗传标记较少,因此使疾病环境更加完整4,7,8。iNPC与星形细胞的分化是非常直接的,即使在多个独立实验室19、29、33之间也具有高度的可重复性。iNPC 可以冷冻在小部分,并直接解冻用于分化目的,这有助于减少实验之间的变化,因为通道数可以保持相似。在许多神经系统疾病中,天体细胞在疾病进展中起着至关重要的作用,因此是一种有趣的细胞类型。天体细胞可用于机械学研究、代谢研究或药物测试检测,通常以单层方式生长。此外,星形细胞可以与小鼠或人类神经元在共同培养系统中结合,以评估星形细胞对神经元生存和形态的影响,这两者都是药物测试34的良好读数。
为了成功使用此协议,需要牢记一些要点和潜在的局限性。例如,人类皮肤成纤维细胞在细胞分裂率和对病毒载体的反应上差异很大。由于这些不是标准化的细胞系,它们和人类本身一样是可变的,因此每一条线都是不同的。至于许多重新编程方法,与几乎没有复制的细胞相比,重新编程成纤维细胞更容易具有中度到快速的细胞分裂率。复制率可能受到皮肤活检质量和处理本身、成纤维细胞通过次数和处理的影响。当与原发性皮肤成纤维细胞一起工作时,重要的是不要让细胞变得过于密集,以避免诱导衰老。如果成纤维细胞生长不好,最好尝试新股或低通道,虽然在某些情况下,疾病本身也可以发挥作用。细胞分裂有时可以通过在成纤维细胞介质中使用 15% 或 20% FBS 来改进,而标准为 10%。
重新编程病毒载体的质量对于成功非常重要。在我们手中,逆转录病毒媒介比扁桃体向量或其他非整合病毒效率更高:然而,这可能取决于病毒载体的质量和纯度。商用逆转录病毒载体套件通常指定病毒载体浓度,并且通常也是特定细胞系的多种感染。重要的是要记住,原纤维细胞不同于公司用于确定病毒载体吸收的细胞系。此外,即使在订购相同的商业套件时,批次之间的变化也是常见的。此外,病毒载体的吸收也因成纤维细胞系而异。有些线可能更敏感,因此被转化的细胞可能会死亡,而其他细胞系可能更耐病毒吸收。因此,确定给定细胞系的转导效率可能很重要,尤其是在细胞系增长缓慢或之前的转换尝试失败时。在我们手中,评估转化需要多少特定的逆转录病毒载体的最佳方法是进行免疫荧光染色与病毒载体的几个稀释。然后可以计算表达每个向量的转基因细胞的数量,以达到70%或更高的转导效率。根据我们的经验,类似的MOI可用于大多数细胞系,但如有必要,可以调整 MOI。
在转换过程中,不要过早分裂细胞至关重要。细胞准备分裂的时间取决于多种因素,包括主细胞系及其特征、使用的病毒载体的质量和介质质量。重要的是,当细胞保持高密度时,转化的成功率要高得多。即使细胞开始改变形态,最好把细胞留在第一口井里,而不是过早分裂它们。如果分裂发生得太早,转化可以停止其进展,并导致细胞分化回成纤维细胞般的形状和行为。此外,与之前观察到的NPC的小型和紧凑细胞体相比,过早稀释它们会导致细胞体更拉长。因此,第一次分裂应始终保守:与过多稀释细胞相比,最好以1:1或1:2的分裂来保持细胞过密集。初步分裂后,预计会有一些细胞死亡。值得注意的是,细胞在分裂后的第一天总是看起来更糟(更平坦),这是正常的。对细胞形状的最佳判断应在2-3天后做出。重要的是,增长因素和媒体组件的质量也至关重要。重要的是要准备少量含有生长因子的媒体,以便充分准备的媒体最多只能使用5-7天。长时间不要将介质保持在室温或 37°C。快速使用,并在执行媒体更改后立即冷藏。此外,将介质的体积保持在 1 mL 而不是 2 mL,尤其对更耐转换的细胞系有帮助。如果细胞快速消耗介质,可以通过介质颜色变化从红色到黄色(酸化率)来观察,则将介质的体积调整到高达 2 mL。媒体的快速消费是一个积极的迹象,在转换的后期,随着扩散的增加,经常会观察到这一点。
NPC 对媒体中是否存在鼓掌也非常敏感,保持累积潜伏时间短非常重要。我们建议潜伏期为2-4分钟,经常在显微镜下检查细胞,看看它们何时分离。分离后离心细胞以从介质中去除酶混合物至关重要。记住通道编号也很重要,因为细胞系在扩展培养后可能会发生变化,导致表达特征的改变。因此,在早期通道冻结许多细胞库存是很重要的。细胞应冷冻在10%DMSO和90%NPC介质中,并长期储存在液氮中。由于这种介质中缺乏血清,使用冷冻室确保缓慢冷冻至关重要,一旦冷冻过夜,立即转移到液氮中。虽然本协议中没有进行克隆选择,但延长培养和传递可能会导致具有良好生长和存活率的初始细胞种群的自然选择。因此,在进行实验时必须牢记通过次数和处理。我们更喜欢使用较低的通道进行实验,如果可能的话,我们不会超过通过细胞系超过20次。由于NPC增长迅速,大量的库存可以冻结在较低的通道进行实验。生长率特别高的细胞系存在更高的介质酸化风险。因此,随着细胞系以不同的速度增长,媒体的数量可能需要根据增殖进行调整。如果细胞持续留在高度酸化的介质中,它会影响控制细胞和疾病细胞系的健康。这导致甚至健康的星形细胞变得被动,影响它们在进一步分化和实验中的使用。
对于星形细胞分化,保持细胞的低密度很重要,因为高密度会阻止细胞分化,并且它们会以更高的速度继续增殖。因此,种子密度需要根据每个细胞系的增殖率进行调整。我们建议尝试不同的播种密度,并使用星形细胞标记进行染色/RT-PCR,以确保适当的分化。使用与神经元共同培养的检测,在健康控制的同时评估 IAs 质量。如果疾病病理学不会导致反应性表型,神经元在与 iAs 接触数天时应保持可行。天体细胞形态在单个细胞系之间可能有很大的差异,并且可能受到疾病表型的影响。此外,在天体细胞受到严重影响的疾病中,它们可能表现出具有较大拉长扩展的活性表型。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢所有患者和健康志愿者将关键样本捐赠给研究。此外,我们感谢罗谢尔·罗德里戈在组织培养方面的持续专家技术援助,以及劳拉·费雷奥洛作为合作者在她的实验室中独立确认了这一技术。这项工作得到了美国国家卫生研究院赠款 R01 NS644912-4 和 RC2 NS69476-01(到 A.L.S.)和帕卡德 ALS 研究补助金 P2ALS 和帮助链接基金会的资助。K.M还获得了瑞士国家科学基金会的资助,以及肌肉萎缩协会、雷特综合症研究信托基金和SCN2A基金会家庭颁发的青年调查员发展奖。
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |