Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.
Die Forschung zu neurologischen Störungen konzentriert sich in erster Linie auf die Auswirkungen von Neuronen auf Krankheitsmechanismen. Die begrenzte Verfügbarkeit von Tiermodellen wirkt sich stark auf die Untersuchung zelltypspezifischer Beiträge zur Krankheit aus. Darüber hinaus spiegeln Tiermodelle in der Regel keine Variabilität in Mutationen und Krankheitskursen wider, die bei menschlichen Patienten beobachtet werden. Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) haben die patientenspezifische Forschung revolutioniert und wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen geschaffen. Die iPSC-Technologie hat jedoch Nachteile wie Zeit, Arbeitsengagement, klonale Selektivität und Verlust epigenetischer Marker. Jüngste Modifikationen dieser Methoden ermöglichen eine direktere Generierung von Zelllinien oder bestimmten Zelltypen, die die klonale Isolation oder einen pluripotenten Stammzellzustand umgehen. Wir haben eine schnelle direkte Konvertierungsmethode entwickelt, um induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) aus Hautfibroblasten zu erzeugen, die retrovirale Vektoren in Kombination mit neuralisierenden Medien verwenden. Die iNPCs können in Neuronen (iNs) Oligodendrozyten (iOs) und Astrozyten (iAs) unterschieden werden. iAs Produktion erleichtert schnelle Arzneimittel- und Krankheitsmechanismus-Tests, da die Differenzierung von iNPCs nur 5 Tage dauert. Darüber hinaus sind iAs einfach zu handhaben und werden in reinen Populationen in großer Zahl erzeugt. Wir entwickelten einen hochreproduzierbaren Co-Kultur-Assay mit Maus-GFP+-Neuronen und Patienten-abgeleiteten iAs, um potenzielle therapeutische Strategien für zahlreiche neurologische und neurodegenerative Erkrankungen zu bewerten. Wichtig ist, dass die iA-Assays auf ein 384-Well-Format skalierbar sind, was die Bewertung mehrerer kleiner Moleküle in einer Platte erleichtert. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige therapeutische Auswertung mehrerer Patientenzelllinien mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund. Die einfache Herstellung und Speicherung von iAs und die Fähigkeit, mehrere Verbindungen in einem Assay zu untersuchen, machen diese Methode anpassungsfähig für die personalisierte Medizin.
Das Verständnis der zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen ist für neurologische Erkrankungen von entscheidender Bedeutung, da sie bei der Entwicklung potenzieller therapeutischer Strategien hilft. Während Tiermodelle in der Vergangenheit der Goldstandard für die Erforschung von Erkrankungen des Nervensystems waren, zeigt die direkte Übersetzung potenzieller Therapien in ein klinisches Umfeld oft einen begrenzten Erfolg1,2,3. Gründe für die fehlende Übersetzung sind mangelnde Variabilität des genetischen Hintergrunds und Mutationen bei Mäusen, unvollständige Darstellung von Krankheitsphänotypen und Variation der Arzneimittelempfindlichkeit oder -dosing bei menschlichen Patienten, die in ininbred Mausstämmen nicht gut abgebildet sind. Darüber hinaus sind für viele seltene neurologische Erkrankungen keine oder nur wenige Tiermodelle verfügbar. Das Studium von Krankheitsmechanismen direkt in relevanten menschlichen Zelltypen könnte die Forschung erleichtern und die Übersetzung in die Klinik verbessern. Bei ZNS-Erkrankungen sind primäre menschliche Zellen schwer zu bergen und stellen eine sehr begrenzte Quelle dar, da Biopsien invasiv sind oder erst im Endstadium der Krankheit postmortal abgerufen werden können. In den letzten 15 Jahren hat die Entwicklung der zellulären Reprogrammierungstechnologie die Fähigkeit, menschliche neurologische und neurodegenerative Erkrankungen in vitro zu modellieren, rasch erweitert.
Herkömmliche Methoden der Zellreprogrammierung beinhalten die Umprogrammierung von Fibroblasten oder anderen Zelltypen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die in der Lage sind, sich aus allen drei Keimschichten4in Zelltypen zu differenzieren. Takahashi und Yamanaka waren die ersten, die zeigten, dass die Reexpression von vier Stammzell-Transkriptionsfaktoren ausreicht, um somatische Zellen in iPSCs5umzuleiten. iPSCs können dann weiter in bestimmte Zelltypen differenziert werden. Der Nachteil dieses Prozesses ist jedoch, dass es arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist, stabile Stammzellklone zu erzeugen und zu isolieren. Somatische Mutationen oder spezifische Aberraden der Mutterzelle werden ebenfalls im Stammzellklon beibehalten und können die Ergebnisse der Studie6beeinflussen. Darüber hinaus deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass der Reprogrammierungsprozess zu Stammzellen wertvolle epigenetische Veränderungen löscht, die zelluläre Krankheitsmechanismen4,7,8beeinflussen könnten. In den letzten Jahren konzentrierten sich die Forscher auf modifizierte Reprogrammierungsmethoden, die eine direktere Generierung verschiedener Zelltypen ermöglichen, während sie den pluripotenten Stammzellzustand9,10,11,12 (in 13,14) umgehen. Erste Durchbrüche ergaben in vitro kombinatorische Reprogrammierung von Fibroblasten auf Kardiomyozyten15, Neuronen16 und Hepatozyten17 durch ektopische Expression mehrerer linienspezifischer Transkriptionsfaktoren oder microRNAs18. Es folgten Studien, die Zellen direkt umprogrammierten, um neurologische Störungen zu modellieren19,20. Wie bereits erwähnt, haben solche direkten Reprogrammierungs- oder Konvertierungsprotokolle potenzielle Vorteile gegenüber klassischen iPSC-Protokollen, einschließlich Geschwindigkeit und Ablation des klonalen Isolationsschritts. Darüber hinaus deuten Beweise darauf hin, dass diese Protokolle es ermöglichen, eine größere Menge an epigenetischen Informationen über das Alter des Patienten aufrechtzuerhalten, und wahrscheinlich gilt dasselbe für die krankheitsrelevanten Marker7,8.
Bis heute konzentrierte sich die meiste In-vitro-Forschung zu neurologischen Störungen hauptsächlich auf Neuronen. Es ist jedoch bekannt, dass andere Zelltypen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten eine entscheidende Rolle bei der Krankheitspathologie und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Amyotropher Lateralsklerose (ALS), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD), Multiple Sklerose (MS) und anderen neurologischen Pathologien wie Rett-Syndrom (RTT), Schlafstörungen ( Sucht, Epilepsie, lysosomale Speicherstörungen, Depressionen, Migräne und pathologische Schmerzen21,22,23,24,25,26. Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und wurden bis vor kurzem aus pathologischer Sicht weitgehend vernachlässigt7. Sie sind heute dafür bekannt, eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung fast aller homeostatischen Funktionen des gesunden ZNS zu spielen. Darüber hinaus ist es offensichtlich, dass sie eine wichtige pathologische Wirkung haben und sehr wertvoll sind, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und therapeutische Strategien zu bewerten19.
In der aktuellen Beschreibung beschreiben wir ein Protokoll zur direkten Umwandlung von menschlichen Patienten-Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) unter Verwendung retroviraler Vektoren, die die Yamanaka-Reprogrammierungsfaktoren (Klf4, Oct3/4, Sox2 und c-Myc) und die anschließende Exposition gegenüber neuralisierenden Medien exdrücken. Frühere Studien haben verschiedene Kombinationen von Transkriptionsfaktoren für die direkte Umprogrammierung auf Neuronalzellen verwendet (rezensiert in 14), aber die im beschriebenen Protokoll verwendeten Faktoren sind im Großen und Ganzen entweder als Plasmide für die hauseigene Produktion von viralen Vektoren oder als kommerziell verfügbar erhältliche, um virale Reprogramming-Kits zu verwenden. Die resultierenden iNPCs können weiter in induzierte Neuronen (iNs)27, Oligodendrozyten (iOs)24 und Astrozyten (iAS)19 differenziert werden, um ihre Rolle bei neurologischen Erkrankungen zu untersuchen. Unser Protokoll beinhaltet keine zeitaufwändige Generierung von iPSCs, die die meisten verfügbaren Protokolle für die Ableitung menschlicher Astrozyten28verwenden. Etwa 98% bis 100% der direkt umprogrammierten iNPCs können sich in GFAP-positive Astrozyten29 differenzieren, verglichen mit nur 2% mit direkter Konvertierungsmethode von Fibroblasten zu Astrozyten30. Kürzlich hat eine vergleichende transkriptomische Studie mit unserer beschriebenen Reprogrammierungsmethode gezeigt, dass iNPCs, die von Spender-Fibroblasten umprogrammiert wurden, alterungsgemäße Merkmale auf transkriptionstrativer und funktioneller Ebene beibehalten können, ähnlich wie bei postmortalen Astrozyten und primären Astrozyten29. Somit ist dieses Umwandlungsprotokoll ein leistungsfähiges Werkzeug, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und neuartige therapeutische Ansätze für altersbedingte neurodegenerative und neurologische Erkrankungen zu bewerten.
Hier beschreiben wir das Protokoll, das verwendet wird, um iNPCs und weitere Differenzierung in iAs zu erzeugen, die am besten für größere kleine molekulare Screening-Assays geeignet sind. Krankheitsmechanismen und Arzneimitteltests mit iAs können mit verschiedenen Methoden wie Kokulturen mit Neuronen oder metabolischen und biochemischen Analysen durchgeführt werden. Der Vorteil dieses Systems ist die Geschwindigkeit und einfache Wartung dieser Zellleitungen im Vergleich zu iPSCs. Darüber hinaus können iNPCs in kleinen Portionen für die iAs-Differenzierung eingefroren werden, was Arzneimitteltests unter konstanten Bedingungen über einen längeren Zeitraum erleichtert. Insgesamt wird ein Vergleich größerer Probenzahlen auf diese Weise möglich, was die Tür öffnet, das therapeutische Potenzial von Verbindungen in einer größeren und repräsentativeren Patientenpopulation zu bewerten.
Zusammenfassend ist die direkte Umwandlung eine schnelle und einfache Methode, um induzierte neuronale Vorläuferzellen aus Patientenhaut-Fibroblasten zu erzeugen. Diese Methode ist vorteilhaft wegen ihrer Geschwindigkeit sowie der großen Anzahl von Zellen, die leicht zu warten sind. Darüber hinaus deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass direkte Reprogrammierungsmethoden weniger epigenetische Markierungen entfernen als klassische iPSC-Reprogrammierungstechnologie, wodurch die Krankheitsumgebung intakter bleibt4,7,8. Die Differenzierung von iNPCs zu Astrozyten ist sehr geradlinig und auch zwischen mehreren unabhängigen Laboratorien sehr reproduzierbar19,29,33. iNPCs können in kleinen Portionen eingefroren und direkt zu Differenzierungszwecken aufgetaut werden, was dazu beiträgt, die Variation zwischen den Experimenten zu reduzieren, da die Durchgangszahlen ähnlich gehalten werden können. Astrozyten spielen bei vielen neurologischen Erkrankungen eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsprogression und sind daher ein interessanter Zelltyp, mit dem man arbeiten kann. Die Astrozyten können für mechanistische Studien, Stoffwechselstudien oder Arzneimitteltest-Assays verwendet werden und werden in der Regel als Monolayer angebaut. Darüber hinaus können Astrozyten in Co-Kultur-Systemen mit Maus- oder menschlichen Neuronen kombiniert werden, um den Einfluss von Astrozyten auf das neuronale Überleben und die Morphologie zu bewerten, die beide gute Auslesungen für Arzneimitteltests sind34.
Um dieses Protokoll erfolgreich nutzen zu können, müssen einige Punkte und mögliche Einschränkungen im Auge behalten werden. Die menschlichen Hautfibroblasten zum Beispiel variieren stark in ihrer Zellteilungsrate sowie der Reaktion auf virale Vektoren. Da es sich nicht um standardisierte Zelllinien handelt, sind sie so variabel wie die Menschheit selbst, jede Linie ist anders. Wie bei vielen Umprogrammierungsmethoden ist es einfacher, Fibroblasten neu zu programmieren, die eine moderate bis schnelle Zellteilungsrate haben, im Vergleich zu Zellen, die sich kaum replizieren. Die Replikationsrate kann durch die Hautbiopsiequalität und die Verarbeitung selbst, durch die Durchgangsnummer der Fibroblasten sowie die Handhabung beeinflusst werden. Bei der Arbeit mit primären Haut-Fibroblasten ist es wichtig, die Zellen nicht zu dicht werden zu lassen, um eine Induktion der Seneszenz zu vermeiden. Wenn die Fibroblasten nicht gut wachsen, ist es am besten, einen neuen Bestand oder einen niedrigeren Durchgang zu versuchen, obwohl in einigen Fällen auch die Krankheit selbst eine Rolle spielen könnte. Die Zellteilung kann manchmal durch die Verwendung von 15% oder 20% FBS in den Fibroblastenmedien im Vergleich zu den Standard 10% verbessert werden.
Die Qualität der Reprogrammierung viraler Vektoren ist von großer Bedeutung für den Erfolg. In unseren Händen waren retrovirale Vektoren effizienter als lentivirale Vektoren oder andere nicht integrierende Viren; Dies könnte jedoch von der Qualität und Reinheit des viralen Vektors abhängen. Kommerzielle retrovirale Vektor-Kits geben in der Regel die virale Vektorkonzentration und oft auch eine Vielzahl von Infektionen für eine bestimmte Zelllinie an. Es ist wichtig zu bedenken, dass primäre Fibroblasten von der Zelllinie abweichen, die von den Unternehmen verwendet wird, um die virale Vektoraufnahme zu bestimmen. Darüber hinaus ist auch bei der Bestellung des gleichen kommerziellen Kits, Variation zwischen Chargen üblich. Darüber hinaus variiert die Aufnahme viraler Vektoren auch zwischen Fibroblasten-Zelllinien. Einige Linien könnten empfindlicher sein und daher transduzierte Zellen sterben, während andere Zelllinien resistenter gegen virale Aufnahme sein könnten. Daher kann die Bestimmung der Transduktionseffizienz für eine bestimmte Zelllinie wichtig sein, insbesondere wenn die Zelllinie langsam wächst oder frühere Konvertierungsversuche fehlgeschlagen sind. In unseren Händen ist der beste Weg, um zu beurteilen, wie viel von einem bestimmten retroviralen Vektor für die Umwandlung benötigt wird, eine immunfluoreszierende Färbung mit mehreren Verdünnungen des viralen Vektors durchzuführen. Die Anzahl der Zellen, die das Transgen für jeden Vektor exemiten, kann dann mit dem Ziel einer Transduktionseffizienz von 70% oder höher gezählt werden. Nach unserer Erfahrung können ähnliche MOIs für die meisten Zelllinien verwendet werden, jedoch kann der MOI bei Bedarf angepasst werden.
Während des Konvertierungsprozesses ist es wichtig, die Zellen nicht zu früh aufzuteilen. Die Zeit, bis die Zellen aufgeteilt werden können, hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der primären Zelllinie und ihrer Eigenschaften, der Qualität des verwendeten viralen Vektors und der Medienqualität. Wichtig ist, dass die Erfolgsrate der Umwandlung viel höher ist, wenn die Zellen bei hoher Dichte gehalten werden. Selbst wenn die Zellen beginnen, die Morphologie zu ändern, ist es besser, die Zellen im ersten Gut länger zu lassen, als sie vorzeitig zu teilen. Wenn die Teilung zu früh erfolgt, kann die Konvertierung in ihrem Fortschritt anhalten und die Zellen dazu bringen, sich wieder zu fibroblastenähnlicher Form und Verhalten zu unterscheiden. Darüber hinaus kann eine zu frühe Verdünnung zu längeren Zellkörpern führen als die kleinen und kompakten Zellkörper der zuvor beobachteten NPCs. Daher sollten die ersten Splits immer konservativ sein; es ist besser, die Zellen mit einem 1:1 oder 1:2-Split zu dicht zu halten, als sie zu sehr zu verdünnen. Nach der anfänglichen Teilung wird mit einem gewissen Zelltod gerechnet. Bemerkenswert ist, dass die Zellen am ersten Tag nach der Spaltung immer schlechter (flacher) aussehen, was normal ist. Die besten Urteile über die Zellform sollten 2-3 Tage später getroffen werden. Wichtig ist, dass auch die Qualität der Wachstumsfaktoren und Medienkomponenten entscheidend ist. Es ist wichtig, kleine Mengen von Medien mit Wachstumsfaktoren vorzubereiten, so dass die vollständig vorbereiteten Medien nur für maximal 5-7 Tage verwendet werden. Halten Sie die Medien nicht bei Raumtemperatur oder 37 °C für längere Zeit. Schnell verwenden und kühlen, sobald der Medienwechsel durchgeführt wird. Darüber hinaus kann es besonders bei Zelllinien helfen, die gegen Umwandlungen resistenter sind, die Medienmenge bei 1 ml statt 2 ml niedrig zu halten. Wenn die Zellen die Medien schnell verbrauchen, was durch eine Änderung der Medienfarbe rot zu gelb (Versauerungsrate) beobachtet werden kann, stellen Sie die Lautstärke des Mediums auf bis zu 2 ml ein. Schneller Medienkonsum ist ein positives Zeichen und wird häufig in späteren Phasen der Konversion bei gleichzeitig erhöhter Proliferation beobachtet.
NPCs sind auch sehr empfindlich auf das Vorhandensein von Accutase in den Medien und es ist sehr wichtig, die Accutase-Inkubationszeit kurz zu halten. Wir empfehlen eine Inkubationszeit von 2-4 Minuten, überprüfen Zellen häufig unter dem Mikroskop, um zu sehen, wenn sie sich gelöst haben. Es ist wichtig, die Zellen nach der Spaltung zu zentrifugieren, um den Enzymmix aus den Medien zu entfernen. Es ist auch wichtig, die Durchgangszahl im Auge zu behalten, da sich Zelllinien bei erweiterter Kultivierung ändern können, was zu einer Änderung von Expressionsprofilen führt. Daher ist es wichtig, viele Zellbestände in frühen Passagen einzufrieren. Zellen sollten in 10% DMSO und 90% NPC-Medien eingefroren und langfristig in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Aufgrund des Mangels an Serum in diesem Medium ist es wichtig, ein langsames Einfrieren mit Gefrierkammern zu gewährleisten und einmal über Nacht eingefroren, sofort in flüssigen Stickstoff zu übertragen. Während in diesem Protokoll keine klonale Selektion durchgeführt wird, ist es möglich, dass erweiterte Kultivierung und Passierung zu einer natürlichen Selektion einer ersten Zellpopulation mit günstigem Wachstum und Überlebensrate führt. Daher ist es wichtig, passage number und handling im Auge zu behalten, wenn Experimente durchgeführt werden. Wir bevorzugen niedrigere Passagen für Experimente zu verwenden, wenn möglich, überschreiten wir nicht die Passierung der Zelllinien für mehr als 20 Mal. Da NPCs schnell wachsen, kann eine große Anzahl von Beständen an niedrigeren Durchgängen für Experimente eingefroren werden. Zelllinien mit besonders hohen Wachstumsraten sind einem höheren Risiko einer Medienversauerung ausgesetzt. Wenn also Zelllinien mit unterschiedlicher Geschwindigkeit wachsen, muss die Menge der Medien möglicherweise basierend auf der Proliferation angepasst werden. Wenn die Zellen kontinuierlich in stark versauerten Medien gelassen werden, kann es die Gesundheit sowohl der Kontroll- als auch der Krankheitszelllinien beeinflussen. Dies bewirkt, dass selbst gesunde Astrozyten reaktiv werden, was ihre Verwendung in weiteren Differenzierungen und Experimenten beeinflusst.
Für die Astrozytendifferenzierung ist es wichtig, die Zellen bei niedriger Dichte zu halten, da eine hohe Dichte die Zellen daran hindert, sich zu differenzieren, und sie sich mit höheren Raten ausbreiten. Daher muss die Saatdichte für jede Zelllinie abhängig von ihrer Proliferationsrate angepasst werden. Wir empfehlen, verschiedene Sädichten auszuprobieren und Färbungen/RT-PCR mit Astrozytenmarkern durchzuführen, um eine angemessene Differenzierung zu gewährleisten. Die Qualität von IAs kann zusammen mit gesunden Kontrollen mit Co-Kultur-Assays mit Neuronen bewertet werden. Sofern Krankheitspathologie nicht zu einem reaktiven Phänotyp führt, sollten Neuronen in Kontakt mit iAs für mehrere Tage lebensfähig bleiben. Die Astrozytenmorphologie kann zwischen den einzelnen Zelllinien stark variieren und kann auch durch den Phänotyp der Krankheit beeinflusst werden. Darüber hinaus können sie bei Krankheiten, bei denen Astrozyten stark betroffen sind, einen reaktiven Phänotyp mit großen, längigen Erweiterungen aufweisen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken allen Patienten und gesunden Freiwilligen für die Bereitstellung kritischer Proben für Forschungsstudien. Darüber hinaus danken wir Rochelle Rodrigo für die kontinuierliche technische Unterstützung in der Gewebekultur und Laura Ferraiuolo für die unabhängige Bestätigung der Technik in ihrem Labor als Mitarbeiterin. Diese Arbeit wurde von den US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 und RC2 NS69476-01 (bis A.L.S.) und dem Packard Center for ALS Research Grant P2ALS und der Helping Link Foundation finanziert. K.M. erhielt auch Fördermittel des Schweizerischen Nationalfonds sowie den Young Investigator Development Award der Muscular Dystrophy Association, des Rett Syndrome Research Trust und der Families of SCN2A foundations.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |