ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。
神経疾患に関する研究は、主にニューロンが疾患メカニズムに及ぼす影響に焦点を当てています。動物モデルの利用が限られていると、疾患に対する細胞型特有の貢献の研究に深刻な影響を及ぼす。さらに、動物モデルは通常、ヒト患者に見られる突然変異および疾患コースの変動性を反映していない。誘導多能性幹細胞(iPSC)の生成のためのリプログラミング方法は、患者固有の研究に革命をもたらし、疾患メカニズムを研究するための貴重なツールを作成しました。しかし、iPSC技術には、時間、労働コミットメント、クローン選択性、エピジェネティックマーカーの喪失などの欠点があります。これらの方法の最近の変更は、クローナル単離または多能性幹細胞状態をバイパスして、細胞系分線または特定の細胞タイプのより直接的な生成を可能にする。我々は、神経化媒体と組み合わせてレトロウイルスベクターを利用した皮膚線維芽細胞から誘導ニューロン前駆細胞(iNNC)を生成する迅速な直接変換方法を開発した。iNNCは、ニューロン(iN)オリゴデンドロサイト(iO)およびアストロサイト(iA)に分化することができる。iAの生産は、iNPCからの分化が5日しかかからなからず、迅速な薬物および疾患メカニズム検査を容易にする。さらに、iAは作業が容易で、多数の純粋な集団で生成されます。我々は、多数の神経変性疾患および神経変性疾患の潜在的な治療戦略を評価するために、マウスGFP+ニューロンおよび患者由来iAを用いて、再現性の高い共培養アッセイを開発した。重要なことに、iAアッセイは384ウェル形式にスケーラブルであり、1つのプレート内の複数の小分子の評価を容易にします。このアプローチは、多様な遺伝的背景を有する複数の患者細胞株の同時治療的評価を可能にする。iAの生産と保存が容易で、1つのアッセイで複数の化合物をスクリーニングする能力は、この方法論を個別化された医療に適応可能なものにします。
潜在的な治療戦略の開発に役立つ神経疾患の基礎となる疾患メカニズムを理解することは重要です。動物モデルは、神経系の疾患を研究するためのゴールドスタンダードであったが、臨床環境への潜在的な治療法の直接翻訳は、多くの場合、限られた成功を示す1、2、3。翻訳の欠如の理由は、マウスの遺伝的背景と突然変異の変動の欠如、疾患の表型の不完全な表示、および近交系マウス株で十分に描かれていないヒト患者における薬物感受性または薬物感受性の変動である。さらに、多くの稀な神経疾患に対して、利用できる動物モデルは全くないか、または少数である。関連するヒト細胞タイプで直接疾患メカニズムを研究することは、研究を促進し、診療所への翻訳を改善する可能性があります。CNS障害の場合、生検が侵襲的であるか、疾患の終末期にのみ死後に取り戻すことができるため、原発性ヒト細胞を取り出し、非常に限られた源を表すのが困難である。過去15年間で、細胞リプログラミング技術の開発は、ヒトの神経学的および神経変性疾患を体型化する能力を急速に拡大してきました。
従来の細胞リプログラミング法では、線維芽細胞または他の細胞型を、3つの全ての胚芽層4から細胞型に分化することができる誘導多能性幹細胞(iPSC)への再プログラミングが含まれる。高橋と山中は、4つの幹細胞転写因子の再発現が体細胞をiPSC5にリダイレクトするのに十分であることを示した最初の人であった。iPSCは、さらに特定の細胞タイプに分けることができます。しかし、このプロセスの欠点は、安定した幹細胞クローンを生成および分離するのに労力がかかり、時間がかかることです。体細胞変異または母細胞の特定の異常は、幹細胞クローンにも維持され、研究結果に影響を与える可能性がある6.さらに、幹細胞へのリプログラミングプロセスは、細胞疾患のメカニズム4、7、8に影響を与える可能性のある貴重なエピジェネティックな変化を消去することを示唆しています。近年、研究者は、多能性幹細胞状態9、10、11、12をバイパスしながら、異なる細胞型のより直接的な生成を可能にする改変リプログラミング方法に焦点を当てた(13,14でレビュー)。初期のブレークスルーは、心筋細胞15に対する線維芽細胞のインビナトリアル・リプログラミングにおいて明らかにされ、ニューロン16および肝細胞17は、複数の系統特異的転写因子またはマイクロRNA18の異所性発現によって明らかにされた。これに続いて、神経疾患19,20をモデル化するために細胞を直接再プログラムする研究が行われた。前述のように、このような直接リプログラミングまたは変換プロトコルは、速度やクローン分離ステップの切り消しを含む古典的なiPSCプロトコルよりも潜在的な利点を有する。さらに、証拠は、これらのプロトコルが患者の年齢に関連するエピジェネティックな情報の多くを維持することを可能にすることを示唆し、おそらく同じことが病気関連マーカー7、8に当てはまる。
現在までに、神経疾患に関するほとんどのインビトロ研究は、主にニューロンに焦点を当ててきました。しかし、アストロサイトなどの他の細胞型は、よく知られています。 ミクログリアおよびオリゴデンドロサイトは、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、多発性硬化症(MS)、および他の神経疾患、ラット症候群(RTT)、睡眠障害、中毒、睡眠障害、中毒、アルツハイマー病などの神経変性疾患の進行に重要な役割を果たす てんかん、リソソーム貯蔵障害、うつ病、片頭痛および病理学的疼痛21、22、23、24、25、26。アストロサイトは中枢神経系(CNS)において最も豊富な細胞型であり、最近まで病理学的観点から広く無視されてきた。彼らは現在、健康なCNSのほぼすべての恒常性機能をサポートする上で重要な役割を果たすることが知られています。さらに、それらは重要な病理学的影響を有し、疾患メカニズムを理解し、治療戦略を評価する上で非常に価値があることが明らかである19。
現在の説明では、山中リプログラミング因子(Klf4、Oct3/4、Sox2およびc-Myc)とその後の神経化培地への暴露を発現するレトロウイルスベクターを用いて、ヒト患者線維芽細胞を誘導ニューロン前駆細胞(iNPC)に直接変換するためのプロトコルを詳述する。これまでの研究では、神経細胞への直接リプログラミングのための転写因子の異なる組み合わせを使用してきましたが(14でレビュー)が、記載されたプロトコルで使用される要因は、ウイルスベクターの家の生産におけるプラスミドとして広く利用可能であるか、またはウイルスリプログラミングキットを行う準備ができている市販品として利用可能です。得られたiNPCは、さらに誘発ニューロン(iN)27、オリゴデンドロサイト(iOs)24およびアストロサイト(iAS)19に分化して、神経疾患におけるその役割を研究することができる。我々のプロトコルは、人間のアストロサイト28の導出に利用されるほとんどの利用可能なプロトコルを使用するiPSCの時間のかかる生成を伴わない。直接再プログラムされたiNPCの約98%〜100%は、線維芽細胞からアストロサイト30への直接変換法を用いた2%と比較して、GFAP陽性アストロサイト29に分化することができる。最近、我々の説明されたリプログラミング法を用いた比較トランスクリプト法の研究は、ドナー線維芽細胞から再プログラムされたiNPCが、死後のアストロサイトおよび第一次アストロサイト29と一致した年齢と同様の転写および機能的レベルで老化特徴を保持できることを示している。このように、この変換プロトコルは、疾患のメカニズムを調査し、年齢関連神経変性疾患および神経疾患に対する新しい治療アプローチを評価するための強力なツールである。
ここでは、大規模な小分子スクリーニングアッセイに最も適したiNCCの生成とiAへのさらなる分化に利用されるプロトコルについて説明する。iAによる疾患メカニズムと薬物検査は、ニューロンとの共培養や代謝および生化学的分析などの異なる方法論を使用して行うことができます。このシステムの利点は、iPSCと比較したこれらの細胞株の速度とメンテナンスの容易さです。さらに、iNPCは、長期間にわたって一定の条件下で薬物検査を容易にするiAs分化のために小さな部分で凍結することができる。全体的に、より大きなサンプル数の比較は、より大きく、より代表的な患者集団における化合物の治療可能性を評価するための扉を開くこの方法で可能になる。
要約すると、直接変換は、患者の皮膚線維芽細胞から誘発されたニューロン前駆細胞を生成する迅速かつ容易な方法である。この方法は、その速度だけでなく、維持しやすい多数の細胞が生成されるために有利です。さらに、証拠の増加は、直接的なリプログラミング方法が古典的なiPSCリプログラミング技術と比較してより少ないエピジェネティックなマークを除去することを示唆している。iNPCのアストロサイトへの分化は、複数の独立した実験室19、29、33の間でも非常に簡単で再現性が高い。iNPCは小さな部分で凍結し、分化の目的のために直接解凍することができ、通過数を同様に保つことができるので、実験間の変動を減らすのに役立ちます。アストロサイトは、多くの神経疾患における疾患進行において重要な役割を果たすため、興味深い細胞タイプです。アストロサイトは、機械研究、代謝研究または薬物検査アッセイに使用することができ、通常は単層として栽培される。さらに、アストロサイトは、マウスまたはヒトニューロンとの共培養系で組み合わせて、アストロサイトが神経細胞の生存および形態に及ぼす影響を評価することができ、いずれも薬物検査34の良い読み出しである。
このプロトコルを正常に使用するには、いくつかの点と潜在的な制限を念頭に置く必要があります。例えばヒト皮膚線維芽細胞は、細胞分裂率ならびにウイルスベクターへの応答において大きく異なる。これらは標準化された細胞株ではないため、人類そのものと同じくらい可変的であり、各線は異なります。多くのリプログラミング方法に関しては、細胞分裂率が中程度から速い線維芽細胞と、ほとんど複製されていない細胞を再プログラムする方が簡単です。複製速度は、皮膚生検の品質および処理自体、ならびに繊維芽細胞の通過数および取り扱いによって影響を受ける可能性がある。原発性皮膚線維芽細胞を扱う場合、老化の誘発を避けるために細胞が密になりすぎないようにすることが重要です。線維芽細胞がうまく成長しない場合は、新しいストックまたはより低い通路を試してみるのが最善ですが、場合によっては病気自体も役割を果たす可能性があります。細胞分裂は、標準10%に比べて繊維芽細胞媒体中で15%または20%FBSを用いることで改善できる場合がある。
リプログラミングウイルスベクターの品質は、成功のために非常に重要です。私たちの手では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたは他の非統合ウイルスと比較してより効率的でした。しかし、これはウイルスベクターの品質と純度に依存する可能性があります。市販のレトロウイルスベクターキットは、通常、ウイルスベクター濃度を指定し、しばしば特定の細胞株に対する感染の多重度を指定する。一次線維芽細胞は、ウイルスベクターの取り込みを決定するために企業が使用する細胞株とは異なることを覚えておいてください。さらに、同じ市販キットを注文する場合でも、バッチ間の変動が一般的である。さらに、ウイルスベクターの取り込みは、線維芽細胞株間でも変化する。一部の行はより敏感であり、したがって、トランスデュースされた細胞は死ぬ可能性がありますが、他の細胞株はウイルス摂取に対してより耐性がある可能性があります。したがって、特定の細胞株のトランスダクション効率を決定することは、特に細胞株がゆっくりと成長しているか、または以前の変換が失敗した場合に重要です。我々の手では、変換に必要な特定のレトロウイルスベクターの量を評価する最良の方法は、ウイルスベクターのいくつかの希釈で免疫蛍光染色を行うことである。その後、トランスジーンを発現する細胞数をベクターごとにカウントし、70%以上の導入効率を目指す。我々の経験では、ほとんどの細胞株に類似したMOIを使用することができますが、MOIは必要に応じて調整することができます。
変換プロセス中に、セルを早く分割しないことが重要です。細胞が分割される準備ができるまでの時間は、一次細胞株とその特性、使用されるウイルスベクターの品質および媒体の品質を含む複数の要因に依存する。重要なのは、細胞が高密度に保たれている場合、変換の成功率ははるかに高くなります。細胞が形態を変え始めたとしても、細胞を早期に分割するよりも長く最初の細胞に残す方が良いです。分割が早すぎると、変換が進行しにくくなり、細胞が線維芽細胞のような形と行動に戻って分化する可能性があります。さらに、それらをあまりにも早く希釈すると、以前に観察されたNPCの小さくてコンパクトな細胞体と比較して、より細長い細胞体をもたらす可能性があります。したがって、最初の分割は常に保守的でなければなりません。細胞を希釈し過ぎるのに比べて、1:1または1:2分割で細胞を密に保つ方が良いです。最初の分割後に細胞死が予想される。注意してください、細胞は常に正常である分割後の最初の日に悪い(お世辞)見えます。細胞の形状に関する最良の判断は、2〜3日後に行われるべきです。重要なのは、成長要因とメディアコンポーネントの品質も重要です。十分に準備されたメディアが最大5〜7日間しか使用されないように、成長因子を含む少量のメディアを準備することが重要です。メディアを室温または37°Cで長期間保管しないでください。メディアの変更が行われるとすぐに、迅速に使用し、冷蔵します。さらに、2 mLではなく1 mLでメディアの量を少なく保つことは、特に変換に対してより耐性のある細胞株に役立ちます。細胞が急速にメディアを消費する場合、赤から黄色へのメディアの色の変化(酸性化速度)によって観察され得る、2 mLまでメディアの体積を調節する。急速なメディア消費は肯定的な兆候であり、多くの場合、増加した増殖と一緒に変換の後期段階で観察されます。
NPCはまた、メディアにおけるアキュクターゼの存在に非常に敏感であり、アキュベート潜伏時間を短くしておくことは非常に重要である。2~4分の潜伏期間を推奨し、顕微鏡下で頻繁に細胞をチェックし、細胞が剥離した時期を確認します。分裂後に細胞を遠心分離して、培地から酵素ミックスを除去することが不可欠である。また、細胞株は拡張培養時に変化し、発現プロファイルの変化につながる可能性がありますので、通過数を念頭に置いておくことも重要です。したがって、初期の通路で多くのセルストックを凍結することが重要です。細胞は10%DMSOおよび90%NPC媒体で凍結し、液体窒素中に長期保存されるべきである。この培地の血清の不足のために凍結チャンバーを使用してゆっくりと凍結し、一晩凍結したら、すぐに液体窒素に移す必要があります。このプロトコルではクローン選択は行われないが、培養および通過の延長が、良好な増殖および生存率を有する初期細胞集団の自然選択につながる可能性がある。そのため、実験を行う際には、通過数や取り扱いを念頭に置いておく必要があります。私たちは実験のために低い通路を使用することを好む、可能であれば、我々は20回以上細胞株を通過を超えない。NPCは急速に成長するため、実験のために、より低い通路で大量の在庫を凍結することができます。特に高い増殖速度を有する細胞株は、培地酸性化のリスクが高い。したがって、細胞株が異なる速度で成長するにつれて、拡散に基づいてメディアの量を調整する必要があります。細胞が高酸性培地中に連続的に残っている場合、対照および疾患細胞株の両方の健康に影響を与える可能性がある。これは、健康なアストロサイトでさえ反応し、さらなる分化および実験におけるその使用に影響を与える。
アストロサイト分化の場合、高密度は細胞の分化を防ぎ、より高い速度で増殖し続けるので、細胞を低密度に保つことが重要です。したがって、播種密度は、それらの増殖速度に依存する各細胞株に対して調整する必要があります。異なる播種密度を試し、適切な分化を確実にするためにアストロサイトマーカーで染色/RT-PCRを行うことをお勧めします。IAの品質は、ニューロンとの共培養アッセイを使用して健康的なコントロールと一緒に評価することができます。疾患病理が反応性表現型につながらない場合、ニューロンは数日間iAと接触して生存可能であり続けるべきである。アストロサイトの形態は、個々の細胞株間で大きく異なる可能性があり、同様に疾患表現型の影響を受ける可能性があります。さらに、アストロサイトが大きな影響を受ける疾患では、大きく細長い延長を有する反応性表現型を示す可能性がある。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、研究に重要なサンプルを寄付してくれたすべての患者と健康なボランティアに感謝します。さらに、ロシェル・ロドリゴの組織培養に関する継続的な専門家の技術支援と、共同研究者として彼女の研究室で技術を独自に確認してくれたローラ・フェライウオロに感謝します。この研究は、米国国立衛生補助金研究所R01 NS644912-4およびRC2 NS69476-01(A.L.S.)およびパッカードALS研究助成金P2ALSとヘルプリンク財団から資金を受け取りました。また.M、スイス国立科学財団から資金を受け取り、筋ジストロフィー協会、レット症候群研究信託、SCN2A財団の家族から若手研究者育成賞を受賞しました。
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |