Vi beskriver en protokoll for å omprogrammere humane hudavledede fibroblaster til induserte nevronale stamceller (iNPCer), og deres påfølgende differensiering til induserte Astrocytter (iAer). Denne metoden fører til rask og reproduserbar generering av iNPCer og iAer i store mengder.
Forskning på nevrologiske lidelser fokuserer primært på effekten av nevroner på sykdomsmekanismer. Begrenset tilgjengelighet av dyremodeller påvirker studien av celletypespesifikke bidrag til sykdom alvorlig. Videre reflekterer dyremodeller vanligvis ikke variasjon i mutasjoner og sykdomsforløp sett hos menneskelige pasienter. Omprogrammeringsmetoder for generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har revolusjonert pasientspesifikk forskning og skapt verdifulle verktøy for å studere sykdomsmekanismer. Imidlertid har iPSC-teknologi ulemper som tid, arbeidsforpliktelse, klonisk selektivitet og tap av epigenetiske markører. Nylige modifikasjoner av disse metodene tillater mer direkte generering av celleavstanser eller bestemte celletyper, omgå klonisolasjon eller en pluripotent stamcelletilstand. Vi har utviklet en rask direkte konverteringsmetode for å generere induserte neuronale stamceller (iNPCer) fra hudfibroblaster som bruker retrovirale vektorer i kombinasjon med nevraliserende medier. INPCene kan differensieres til nevroner (iNs) oligodendrocytter (iOs) og astrocytter (iAer). iAs produksjon letter rask testing av legemiddel- og sykdomsmekanismer, da differensiering fra iNPCer bare tar 5 dager. Dessuten er iAer enkle å jobbe med og genereres i rene populasjoner i stort antall. Vi utviklet en svært reproduserbar co-kulturanalyse ved hjelp av mus GFP + nevroner og pasientavledede iAer for å evaluere potensielle terapeutiske strategier for mange nevrologiske og nevrodegenerative lidelser. Det er viktig at iA-analysene er skalerbare til 384-brønnsformat som letter evalueringen av flere små molekyler i en plate. Denne tilnærmingen tillater samtidig terapeutisk evaluering av flere pasientcellelinjer med forskjellig genetisk bakgrunn. Enkel produksjon og lagring av iAer og kapasitet til å screene flere forbindelser i en analyse gjør denne metoden tilpasningsdyktig for personlig medisin.
Forståelse av underliggende sykdomsmekanismer er avgjørende for nevrologiske sykdommer da det hjelper i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier. Mens dyremodeller historisk har vært gullstandarden for å forske på sykdommer i nervesystemet, viser den direkte oversettelsen av potensielle terapier til en klinisk setting ofte begrenset suksess1,2,3. Årsaker til mangel på oversettelse er mangel på variasjon i genetisk bakgrunn og mutasjoner hos mus, ufullstendig visning av sykdomsfenotyper og variasjon i legemiddelfølsomhet eller dosering hos menneskelige pasienter som ikke er avbildet godt i innavlede musestammer. Videre, for mange sjeldne nevrologiske lidelser, er det ingen eller få dyremodeller tilgjengelig. Å studere sykdomsmekanismer direkte i relevante menneskelige celletyper kan legge til rette for forskning og forbedre oversettelsen til klinikken. For CNS-lidelser er primære menneskelige celler vanskelig å hente og representere en svært begrenset kilde da biopsier er invasive eller bare kan hentes etter mortem på slutten av sykdommen. I løpet av de siste 15 årene har utviklingen av cellulær omprogrammeringsteknologi raskt utvidet evnen til å modellere menneskelige nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer in vitro.
Tradisjonelle metoder for celleprogrammering innebærer omprogrammering av fibroblaster eller andre celletyper til induserte pluripotente stamceller (iPSCer) som er i stand til å differensiere til celletyper fra alle trebakterielagene 4. Takahashi og Yamanaka var de første som viste at re-uttrykk for fire stamcelletranskripsjonsfaktorer er tilstrekkelig til å omdirigere somatiske celler til å bli iPSCer5. iPSCer kan deretter differensieres ytterligere til bestemte celletyper. Ulempen med denne prosessen er imidlertid at det er arbeidskrevende og tidkrevende å generere og isolere stabile stamcellekloner. Somatiske mutasjoner eller spesifikke avvik i morscellen opprettholdes også i stamcelleklonen og kan påvirke resultatene av studien6. I tillegg tyder økende bevis på at omprogrammeringsprosessen til stamceller sletter verdifulle epigenetiske endringer som kan påvirke cellulære sykdomsmekanismer4,7,8. I de senere år fokuserte forskere på modifiserte omprogrammeringsmetoder som tillater en mer direkte generasjon av forskjellige celletyper mens de omgår den pluripotente stamcelletilstanden9,10,11,12 (gjennomgått i 13,14). Innledende gjennombrudd avslørte in vitro kombinatorisk reprogrammering av fibroblaster til kardiomyocytter15, nevroner16 og hepatocytter17 ved ektopisk uttrykk for flere avstamningsspesifikke transkripsjonsfaktorer eller microRNAer18. Dette ble etterfulgt av studier som direkte omprogrammerte celler for å modellere nevrologiske lidelser19,20. Som nevnt ovenfor har slike direkte omprogrammerings- eller konverteringsprotokoller potensielle fordeler i forhold til klassiske iPSC-protokoller, inkludert hastighet og ablasjon av klonisk isolasjonstrinn. Videre tyder bevis på at disse protokollene tillater å opprettholde en større mengde epigenetisk informasjon relatert til pasientens alder og sannsynligvis det samme gjelder for sykdomsrelevante markører7,8.
Til dags dato har de fleste in vitro-forskning på nevrologiske lidelser primært vært fokusert på nevroner. Det er imidlertid velkjent at andre celletyper som astrocytter, mikroglia og oligodendrocytter spiller en kritisk rolle i sykdomspatologi og progresjon av nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS), multippel sklerose (MS) og andre nevrologiske patologier som Rett syndrom (RTT), søvnforstyrrelser, avhengighet, epilepsi, lysosomale lagringsforstyrrelser, depresjon, migrene og patologisk smerte21,22,23,24,25,26. Astrocytter er den mest tallrike celletypen i sentralnervesystemet (CNS) og inntil nylig har de blitt bredt neglisjert fra et patologisk synspunkt7. De er nå kjent for å ha en kritisk rolle i å støtte nesten alle homeostatiske funksjoner i det sunne CNS. I tillegg er det tydelig at de har en viktig patologisk innvirkning og er svært verdifulle i å forstå sykdomsmekanisme og evaluere terapeutiske strategier19.
I den nåværende beskrivelsen beskriver vi en protokoll for direkte konvertering av menneskelige pasientfibroblaster til induserte Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) ved hjelp av retrovirale vektorer som uttrykker Yamanaka-omprogrammeringsfaktorene (Klf4, Oct3/4, Sox2 og c-Myc) og påfølgende eksponering for nevraliserende medier. Tidligere studier har brukt forskjellige kombinasjoner av transkripsjonelle faktorer for direkte omprogrammering til nevrale celler (gjennomgått i 14), men faktorene som brukes i den beskrevne protokollen er bredt tilgjengelige enten som plasmider for i husproduksjon av virale vektorer, eller som kommersielt tilgjengelige klare til å gå virale omprogrammeringssett. De resulterende iNPCene kan differensieres ytterligere til induserte nevroner (iNs)27, oligodendrocytter (iOs)24 og astrocytter (iAS)19 for å studere sin rolle i nevrologiske sykdommer. Vår protokoll innebærer ikke tidkrevende generering av iPSCer som de fleste tilgjengelige protokoller bruker for avledning av menneskelige astrocytter28. Omtrent 98% til 100% av direkte omprogrammerte iNPCer kan skille seg ut i GFAP-positive astrocytter29 sammenlignet med bare 2% ved hjelp av direkte konverteringsmetode fra fibroblaster til astrocytter30. Nylig har en komparativ transkripsjonsstudie ved hjelp av vår beskrevne omprogrammeringsmetode vist at iNPCer omprogrammert fra donorfibroblaster kan beholde aldringsfunksjoner på transkripsjonelt og funksjonelt nivå som ligner alderstilpassede postmortem astrocytter og primære astrocytter29. Dermed er denne konverteringsprotokollen et kraftig verktøy for å undersøke sykdomsmekanismer og evaluere nye terapeutiske tilnærminger for aldersrelaterte nevrodegenerative og nevrologiske lidelser.
Her beskriver vi protokollen som brukes til å generere iNPCer og ytterligere differensiering i iAer, som er de mest egnede for små molekylære screeninganalyser i større skala. Sykdomsmekanismer og legemiddeltesting med iAer kan gjøres ved hjelp av forskjellige metoder som samkulturer med nevroner eller metabolsk og biokjemisk analyse. Fordelen med dette systemet er hastigheten og enkelheten ved vedlikehold av disse cellelinjene sammenlignet med iPSCer. Videre kan iNPCer fryses i små porsjoner for iAs differensiering som letter narkotikatesting under konstante forhold over lengre perioder. Samlet sett blir sammenligning av større utvalgstall mulig på denne måten som åpner døren for å evaluere terapeutisk potensial for forbindelser i en større og mer representativ pasientpopulasjon.
Oppsummert er den direkte konverteringen en rask og enkel metode for å generere induserte nevronale stamceller fra pasienthudfibroblaster. Denne metoden er fordelaktig på grunn av hastigheten så vel som det store antallet celler som genereres som er enkle å vedlikeholde. Videre tyder økende bevis på at direkte omprogrammeringsmetoder fjerner mindre epigenetiske merker sammenlignet med klassisk iPSC-omprogrammeringsteknologi, og dermed etterlater sykdomsmiljøet mer intakt4,7,8. Differensiering av iNPCer til astrocytter er veldig rett frem og svært reproduserbar selv mellom flere uavhengige laboratorier19,29,33. iNPCer kan fryses i små porsjoner og tines direkte for differensieringsformål, noe som bidrar til å redusere variasjon mellom eksperimenter siden passasjenumre kan holdes like. Astrocytter spiller en avgjørende rolle i sykdomsprogresjon i mange nevrologiske sykdommer og er derfor en interessant celletype å jobbe med. Astrocyttene kan brukes til mekanistiske studier, metabolske studier eller legemiddeltestingsanalyser og dyrkes vanligvis som monolayers. Videre kan astrocytter kombineres i samkultursystemer med mus eller menneskelige nevroner for å vurdere virkningen av astrocytter på nevronal overlevelse og morfologi, som begge er gode avlesninger for legemiddeltesting34.
For å kunne bruke denne protokollen, må noen få punkter og potensielle begrensninger huskes. De menneskelige hudfibroblaster for eksempel varierer sterkt i celledelingshastigheten samt responsen på virale vektorer. Siden disse ikke er standardiserte cellelinjer, er de like variable som menneskeheten selv, hver linje er forskjellig. Når det gjelder mange omprogrammeringsmetoder, er det lettere å omprogrammere fibroblaster som har en moderat til rask celledelingshastighet kontra celler som knapt replikerer. Replikeringshastigheten kan påvirkes av hudens biopsikvalitet og selve behandlingen, ved passeringsnummeret til fibroblaster samt håndtering. Når du arbeider med primære hudfibroblaster, er det viktig å ikke la cellene bli for tette for å unngå induksjon av senescence. Hvis fibroblaster ikke vokser godt, er det best å prøve en ny bestand eller en lavere passasje, men i noen tilfeller kan sykdommen selv også spille en rolle. Celledeling kan noen ganger forbedres ved å bruke 15% eller 20% FBS i fibroblastmediet sammenlignet med standard 10%.
Kvaliteten på omprogrammering av virale vektorer er av høy betydning for suksess. I våre hender var retrovirale vektorer mer effektive sammenlignet med lentivirale vektorer eller andre ikke-integrerte virus; Dette kan imidlertid være avhengig av viral vektorkvalitet og renhet. Kommersielle retrovirale vektorsett spesifiserer vanligvis viral vektorkonsentrasjon og ofte også et mangfold av infeksjon for en bestemt cellelinje. Det er viktig å huske på at primære fibroblaster er forskjellig fra cellelinjen som brukes av selskapene til å bestemme viral vektoropptak. Videre, selv når du bestiller det samme kommersielle settet, er variasjon mellom partier vanlig. Videre varierer opptaket av virale vektorer også mellom fibroblastcellelinjer. Noen linjer kan være mer følsomme og derfor kan transinduserte celler dø, mens andre cellelinjer kan være mer motstandsdyktige mot viralt opptak. Dermed kan det være viktig å bestemme transduksjonseffektivitet for en gitt cellelinje, spesielt hvis cellelinjen vokser sakte eller tidligere konverteringsforsøk mislyktes. I våre hender er den beste måten å evaluere hvor mye av en bestemt retroviral vektor som trengs for konvertering, å utføre en immunfluorescerende farging med flere fortynninger av virusvektoren. Antall celler som uttrykker transgene for hver vektor kan deretter telles, med sikte på en transduksjonseffektivitet på 70% eller høyere. Etter vår erfaring kan lignende MOIer brukes til de fleste cellelinjer, men MOI kan justeres om nødvendig.
Under konverteringsprosessen er det viktig å ikke dele cellene for tidlig. Tiden til cellene er klare til å deles, avhenger av flere faktorer, inkludert primærcellelinjen og dens egenskaper, kvaliteten på den virale vektoren som brukes og mediekvaliteten. Det er viktig at suksessraten for konverteringen er mye høyere når cellene holdes med høy tetthet. Selv om cellene begynner å endre morfologi, er det bedre å forlate cellene i den første brønnen lenger enn å dele dem for tidlig. Hvis delingen oppstår for tidlig, kan konverteringen stoppe i fremdriften og føre til at cellene skiller seg tilbake til fibroblastlignende form og oppførsel. Videre kan fortynning av dem for tidlig føre til mer langstrakte cellelegemer sammenlignet med de små og kompakte cellelegemene til NPCene som ble observert tidligere. Dermed bør de første splittelsene alltid være konservative; det er bedre å holde cellene for tette med en 1: 1 eller 1: 2 splitt sammenlignet med å fortynne dem for mye. Noe celledød forventes etter den første splitten. Vær oppmerksom på at cellene alltid ser verre ut (flatere) den første dagen etter splitting, noe som er normalt. Beste vurderinger på celleform bør gjøres 2-3 dager senere. Det er viktig at kvaliteten på vekstfaktorene og mediekomponentene også er avgjørende. Det er viktig å forberede små mengder medier som inneholder vekstfaktorer, slik at de fullt forberedte mediene bare vil bli brukt i maksimalt 5-7 dager. Ikke hold mediet ved romtemperatur eller 37 °C over lengre tid. Bruk raskt og kjøl så snart medieskiftet er utført. I tillegg kan det å holde medievolumet lavt på 1 ml i stedet for 2 ml hjelpe spesielt for cellelinjer som er mer motstandsdyktige mot konvertering. Hvis cellene bruker mediet raskt, noe som kan observeres ved en endring i mediefargeform rød til gul (forsuringshastighet), juster volumet av mediet til opptil 2 ml. Raskt medieforbruk er et positivt tegn og observeres ofte på senere stadier av konvertering sammen med økt spredning.
NPCer er også svært følsomme for tilstedeværelsen av accutase i media, og det er svært viktig å holde accutase inkubasjonstiden kort. Vi anbefaler en inkubasjonsperiode på 2-4 minutter, sjekk celler ofte under mikroskopet for å se når de har løsnet. Det er viktig å sentrifugere cellene etter splitting for å fjerne enzymblandingen fra mediet. Det er også viktig å huske på passasjenummeret, da cellelinjer kan endres ved utvidet dyrking som fører til endring av uttrykksprofiler. Dermed er det viktig å fryse mange cellelagre ved tidlige passasjer. Celler bør fryses i 10% DMSO og 90% NPC-medier og lagres på lang sikt i flytende nitrogen. På grunn av mangel på serum i dette mediet er det viktig å sikre en langsom frysing ved hjelp av frysekamre og når det er frosset over natten, overføres umiddelbart til flytende nitrogen. Selv om det ikke utføres klonisk seleksjon i denne protokollen, er det mulig at utvidet dyrking og passivisering fører til naturlig utvalg av en innledende cellepopulasjon med gunstig vekst og overlevelsesrate. Derfor er det viktig å huske på passasjenummer og håndtering når du utfører eksperimenter. Vi foretrekker å bruke lavere passasjer for eksperimenter, hvis mulig, overskrider vi ikke å passere cellelinjene i mer enn 20 ganger. Siden NPC-ene vokser raskt, kan et stort antall aksjer fryses ved lavere passasjer for eksperimenter. Cellelinjer med særlig høy vekstrate har høyere risiko for medieforsuring. Etter hvert som cellelinjer vokser med forskjellig hastighet, kan det derfor hende at mediemengden må justeres basert på spredning. Hvis cellene kontinuerlig blir igjen i svært sure medier, kan det påvirke helsen til både kontroll- og sykdomscellelinjer. Dette fører til at selv sunne astrocytter blir reaktive, noe som påvirker bruken i ytterligere differensiering og eksperimenter.
For astrocyttdifferensiering er det viktig å holde cellene i lav tetthet, da høy tetthet vil forhindre at cellene differensierer, og de vil fortsette å spre seg med høyere hastigheter. Dermed må såddtetthet justeres for hver cellelinje avhengig av spredningshastigheten. Vi anbefaler at du prøver forskjellige såddtettheter og utfører flekker / RT-PCR med astrocyttmarkører for å sikre riktig differensiering. IAs kvalitet kan vurderes sammen med sunne kontroller ved hjelp av samkulturanalyser med nevroner. Forutsatt sykdomspatologi fører ikke til en reaktiv fenotype, nevroner bør forbli levedyktige i kontakt med iAer i flere dager. Astrocyttmorfologi kan variere sterkt mellom individuelle cellelinjer og kan også påvirkes av sykdomsfenotypen. Videre, i sykdommer der astrocytter er sterkt påvirket, kan de vise en reaktiv fenotype med store, langstrakte forlengelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle pasienter og friske frivillige for å donere kritiske prøver til forskningsstudier. Videre takker vi Rochelle Rodrigo for kontinuerlig ekspert teknisk assistanse i vevskultur og Laura Ferraiuolo for uavhengig bekreftelse av teknikken i laboratoriet hennes som samarbeidspartner. Dette arbeidet fikk støtte fra US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 og RC2 NS69476-01 (til A.L.S.) og Packard Center for ALS Research Grant P2ALS og Helping Link Foundation. K.M. mottok også støtte fra Swiss National Science Foundation samt Young Investigator Development Award fra Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust og Families of SCN2A foundations.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |