Vi beskriver ett protokoll för att omprogrammera mänskliga huden-härledda fibroblaster till inducerad neuronal stamceller (iNPC) och deras efterföljande differentiering till inducerad Astrocytes (IAs). Denna metod leder till snabb och reproducerbar generering av iNPC:er och iAs i stora mängder.
Forskning om neurologiska sjukdomar fokuserar främst på neuroners inverkan på sjukdomsmekanismer. Begränsad tillgång till djurmodeller påverkar allvarligt studien av celltypsspecifika bidrag till sjukdom. Dessutom återspeglar djurmodeller vanligtvis inte variabilitet i mutationer och sjukdomskurser som ses hos mänskliga patienter. Omprogrammeringsmetoder för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har revolutionerat patientspecifik forskning och skapat värdefulla verktyg för att studera sjukdomsmekanismer. IPSC-tekniken har dock nackdelar som tid, arbetsengagemang, klonurval selektivitet och förlust av epigenetiska markörer. De senaste ändringarna av dessa metoder möjliggör mer direkt generering av cellstammar eller specifika celltyper, kringgå klonurisolering eller ett pluripotent stamcellstillstånd. Vi har utvecklat en snabb direkt konverteringsmetod för att generera inducerade neuronala stamceller (iNPC) från hudfibroblaster som använder retrovirala vektorer i kombination med neuraliserande media. INPC:erna kan differentieras till nervceller (iNs) oligodendrocyter (iOs) och astrocyter (iAs). iAs produktion underlättar snabb testning av läkemedel och sjukdomsmekanismer eftersom differentiering från iNPC bara tar 5 dagar. Dessutom är iAs lätta att arbeta med och genereras i rena populationer i stort antal. Vi utvecklat en mycket reproducerbar co-culture analys med mus GFP + nervceller och patienten härledda iAs för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar. Viktigt är att iA-analyserna är skalbara till 384-brunnsformat som underlättar utvärderingen av flera små molekyler i en platta. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig terapeutisk utvärdering av flera patient cellinjer med olika genetisk bakgrund. Enkel produktion och lagring av iAs och kapacitet att screena flera föreningar i en analys gör denna metod anpassningsbar för personlig medicin.
Att förstå underliggande sjukdomsmekanismer är avgörande för neurologiska sjukdomar eftersom det hjälper till att utveckla potentiella terapeutiska strategier. Medan djurmodeller historiskt har varit guldstandarden för att undersöka sjukdomar i nervsystemet, visar den direkta översättningen av potentiella terapier till en klinisk miljö ofta begränsad framgång1,2,3. Orsakerna till bristen på översättning är brist på variation av genetisk bakgrund och mutationer hos möss, ofullständig visning av sjukdom fenotyper och variation i läkemedelskänslighet eller dosering hos mänskliga patienter som inte avbildas väl i inavlade musstammar. Dessutom, för många sällsynta neurologiska störningar, finns inga eller få djurmodeller tillgängliga. Att studera sjukdomsmekanismer direkt i relevanta mänskliga celltyper kan underlätta forskning och förbättra översättningen till kliniken. För CNS-störningar är primära mänskliga celler svåra att hämta och representerar en mycket begränsad källa eftersom tarmbiopsier är invasiva eller endast kan hämtas efter döden i slutet av sjukdomen. Under de senaste 15 åren har utvecklingen av cellulär omprogrammeringsteknik snabbt utökat förmågan att modellera mänskliga neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar in vitro.
Traditionella metoder för cellomprogrammering innebär omprogrammering av fibroblaster eller andra celltyper till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som kan differentieras till celltyper från alla trebakterieskikten 4. Takahashi och Yamanaka var de första som visade att återuttryck av fyra stamcellsutskriftsfaktorer är tillräckligt för att omdirigera somatiska celler för att bli iPSCs5. iPSCs kan sedan differentieras ytterligare till specifika celltyper. Nackdelen med denna process är dock att det är arbetsintensivt och tidskrävande att generera och isolera stabila stamcellskloner. Somatiska mutationer eller specifika avvikelser i modercellen upprätthålls också i stamcellsklonen och kan påverka resultaten av studien6. Dessutom tyder ökande bevis på att omprogrammeringsprocessen till stamceller raderar värdefulla epigenetiska förändringar som kan påverka cellulärasjukdomsmekanismer 4,7,8. Under de senaste åren fokuserade forskarna på modifierade omprogrammeringsmetoder som möjliggör en mer direkt generation av olika celltyper samtidigt som de kringgår det pluripotenta stamcellstillståndet9,10,11,12 (granskat i 13,14). De första genombrotten visade in vitro kombinatoriska omprogrammering av fibroblaster till kardiomyocyter15,nervceller16 och hepatocyter17 genom utomkvedshavandeskap av flera härstamning-specifika transkription faktorer eller microRNAs18. Detta följdes av studier som direkt omprogrammerar celler för att modelleraneurologiska störningar 19,20. Som nämnts ovan har sådana direkt omprogrammerings- eller konverteringsprotokoll potentiella fördelar jämfört med klassiska iPSC-protokoll, inklusive hastighet och ablation av klonisoleringssteget. Dessutom tyder bevis på att dessa protokoll gör det möjligt att upprätthålla en större mängd epigenetisk information relaterad till patientens ålder och sannolikt gäller samma sak för sjukdomsrelevantamarkörer 7,8.
Hittills har de flesta in vitro-forskning om neurologiska sjukdomar främst fokuserats på nervceller. Det är dock välkänt att andra celltyper som astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter spelar en avgörande roll i sjukdomspatologi och progression av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateral skleros (ALS), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), multipel skleros (MS) och andra neurologiska patologier som Rett syndrom (RTT), sömnstörningar, missbruk, epilepsi, lysosomal lagringsstörningar, depression, migrän och patologisksmärta 21,22,23,24,25,26. Astrocyter är den vanligaste celltypen i centrala nervsystemet (CNS) och fram till nyligen har de i stort sett försummats ur patologisksynvinkel 7. De är nu kända för att ha en kritisk roll i att stödja nästan alla homeostatiska funktioner i friska CNS. Dessutom är det uppenbart att de har en viktig patologisk inverkan och är mycket värdefulla för att förstå sjukdomsmekanismen och utvärdera terapeutiska strategier19.
I den aktuella beskrivningen beskriver vi ett protokoll för direkt omvandling av mänskliga patienten fibroblaster till inducerad neuronal stamceller (iNPCs) med retrovirala vektorer som uttrycker Yamanaka omprogrammering faktorer (Klf4, Oct3/4, Sox2 och c-Myc) och efterföljande exponering för neuraliserande medier. Tidigare studier har använt olika kombinationer av transkriptionella faktorer för direkt omprogrammering till neurala celler (ses över 14), men de faktorer som används i det beskrivna protokollet är i stort sett tillgängliga antingen som plasmider för in husproduktion av virusvektorer, eller som kommersiellt tillgängliga redo att gå virala omprogrammeringssatser. De resulterande iNPC: erna kan differentieras ytterligare till inducerade nervceller (iNs)27, oligodendrocyter (iOs)24 och astrocyter (iAS)19 för att studera deras roll i neurologiska sjukdomar. Vårt protokoll innebär inte tidskrävande generering av iPSCs som de flesta tillgängliga protokoll använder för härledning av mänskliga astrocyter28. Cirka 98% till 100% av direkt omprogrammerade iNPC kan skilja sig åt i GFAP-positiva astrocyter29 jämfört med endast 2% med direkt konverteringsmetod från fibroblaster till astrocyter30. Nyligen har en jämförande transkriptomisk studie med vår beskrivna omprogrammeringsmetod visat att iNPC omprogrammerade från donatorfibroblaster kan behålla åldrande funktioner på transkriptionell och funktionell nivå som liknar ålder matchade postmortem astrocyter och primära astrocyter29. Således är detta omvandlingsprotokoll ett kraftfullt verktyg för att undersöka sjukdomsmekanismer och utvärdera nya terapeutiska metoder för åldersrelaterade neurodegenerativa och neurologiska störningar.
Här beskriver vi protokollet som används för att generera iNPC: er och ytterligare differentiering i iAs, som är de mest lämpade för småskaliga små molekylära screening analyser. Sjukdomsmekanismer och drogtester med iAs kan göras med olika metoder såsom samkulturer med nervceller eller metabolisk och biokemisk analys. Fördelen med detta system är hastigheten och enkel underhåll av dessa cellinjer jämfört med iPSCs. Dessutom kan iNPC:er frysas i små portioner för differentiering av iAs, vilket underlättar läkemedelstester under konstanta förhållanden under längre tidsperioder. Sammantaget blir jämförelse av större provnummer möjlig på detta sätt vilket öppnar dörren för att utvärdera terapeutisk potential hos föreningar i en större och mer representativ patientpopulation.
Sammanfattningsvis är den direkta omvandlingen en snabb och enkel metod för att generera inducerade neuronala stamceller från patientens hudfibroblaster. Denna metod är fördelaktig på grund av dess hastighet samt det stora antalet celler som genereras som är lätta att underhålla. Dessutom tyder ökande bevis på att direkta omprogrammeringsmetoder tar bort mindre epigenetiska märken jämfört med klassisk iPSC-omprogrammeringsteknik, vilket gör sjukdomsmiljönmer intakt 4,7,8. Differentiering av iNPC till astrocyter är mycket rakt fram och mycket reproducerbar även mellan flera oberoendelaboratorier 19,29,33. iNPC:er kan frysas i små portioner och tinas direkt för differentieringsändamål, vilket bidrar till att minska variationen mellan experiment eftersom passagenummer kan hållas likartade. Astrocyter spelar en avgörande roll i sjukdomsprogression i många neurologiska sjukdomar och är därför en intressant celltyp att arbeta med. Astrocyterna kan användas för mekanistiska studier, metaboliska studier eller drogtestningsanalyser och odlas vanligtvis som monoskikt. Dessutom kan astrocyter kombineras i samkultursystem med mus eller mänskliga nervceller för att bedöma astrocyternas inverkan på neuronal överlevnad och morfologi, som båda är bra avläsningar fördrogtestning 34.
För att kunna använda detta protokoll måste några punkter och potentiella begränsningar hållas i åtanke. Den mänskliga huden fibroblaster till exempel varierar kraftigt i deras celldelningshastighet samt svar på virusvektorer. Eftersom dessa inte är standardiserade cellinjer är de lika varierande som mänskligheten själv, varje rad är annorlunda. När det gäller många omprogrammeringsmetoder är det lättare att omprogrammera fibroblaster som har en måttlig till snabb celldelningshastighet jämfört med celler som knappt replikerar. Replikeringshastigheten kan påverkas av hudens biopsikvalitet och bearbetning i sig, genom passagenumret för fibroblasterna samt hanteringen. När du arbetar med primära hudfibroblaster är det viktigt att inte låta cellerna bli för täta för att undvika induktion av senescens. Om fibroblasterna inte växer bra är det bäst att prova ett nytt lager eller en lägre passage, även om sjukdomen i vissa fall också kan spela en roll. Celldelning kan ibland förbättras genom att använda 15% eller 20% FBS i fibroblastmedierna jämfört med standard 10%.
Kvaliteten på omprogrammering av virusvektorer är av stor betydelse för framgång. I våra händer var retrovirala vektorer effektivare jämfört med lentivirala vektorer eller andra icke-integrerande virus; Detta kan dock vara beroende av den virala vektorkvaliteten och renheten. Kommersiella retrovirala vektorsatser anger vanligtvis virusvektorkoncentrationen och ofta också en multiplicitet av infektion för en viss cellinje. Det är viktigt att komma ihåg att primära fibroblaster skiljer sig från den cellinje som används av företagen för att bestämma viral vektorupptag. Dessutom är variation mellan partier vanligt även vid beställning av samma kommersiella kit. Dessutom varierar upptaget av virusvektorer också mellan fibroblast cellinjer. Vissa linjer kan vara känsligare och därför kan transduced celler dö, medan andra cellinjer kan vara mer resistenta mot viralt upptag. Att bestämma omlastningseffektiviteten för en viss cellinje kan därför vara viktigt, särskilt om cellinjen växer långsamt eller tidigare konverteringsförsök misslyckades. I våra händer är det bästa sättet att utvärdera hur mycket av en specifik retroviral vektor som behövs för konvertering att utföra en immunofluorescerande färgning med flera utspädningar av virusvektorn. Antalet celler som uttrycker transgenen för varje vektor kan sedan räknas, med målet att en transduktionseffektivitet på 70% eller högre. Enligt vår erfarenhet kan liknande MOIs användas för de flesta cellinjer men MOI kan justeras om det behövs.
Under konverteringsprocessen är det viktigt att inte dela cellerna för tidigt. Tiden tills cellerna är redo att delas beror på flera faktorer, inklusive den primära cellinjen och dess egenskaper, kvaliteten på den virusvektor som används och mediekvaliteten. Viktigt är att konverteringens framgångsgrad är mycket högre när cellerna hålls med hög densitet. Även om cellerna börjar ändra morfologi är det bättre att lämna cellerna i den första brunnen längre än att dela dem i förtid. Om delningen sker för tidigt kan omvandlingen stoppas i dess framsteg och leda cellerna att skilja tillbaka till fibroblastliknande form och beteende. Dessutom kan utspädning av dem för tidigt resultera i mer långsträckta cellkroppar jämfört med de små och kompakta cellkropparna i de NPC som observerats tidigare. Således bör de första uppdelningarna alltid vara konservativa; det är bättre att hålla cellerna för täta med en 1:1 eller 1:2 split jämfört med att späda ut dem för mycket. En del celldöd förväntas efter den första delningen. Observera att cellerna alltid ser värre ut (plattare) den första dagen efter delning, vilket är normalt. Bästa bedömningar av cellform bör göras 2-3 dagar senare. Viktigt är att kvaliteten på tillväxtfaktorerna och mediekomponenterna också är avgörande. Det är viktigt att förbereda små mängder media som innehåller tillväxtfaktorer så att de fullt förberedda medierna endast kommer att användas i högst 5-7 dagar. Förvara inte media i rumstemperatur eller 37°C under längre tidsperioder. Använd snabbt och kyl så snart mediebytet utförs. Dessutom kan det hjälpa särskilt för cellinjer som är mer resistenta mot konvertering att hålla medievolymen låg vid 1 ml istället för 2 ml. Om cellerna förbrukar mediet snabbt, vilket kan observeras genom en förändring i mediefärgformen röd till gul (försurningshastighet), justera mediets volym till upp till 2 ml. Snabb mediekonsumtion är ett positivt tecken och observeras ofta i senare stadier av konverteringen tillsammans med ökad spridning.
Nödlidande lån är också mycket känsliga för förekomsten av accutas i medierna, och det är mycket viktigt att hålla inkubationstiden för accutas kort. Vi rekommenderar en inkubationstid på 2-4 minuter, kontrollera celler ofta under mikroskopet för att se när de har lossnat. Det är viktigt att centrifuga cellerna efter delning för att ta bort enzymblandningen från mediet. Det är också viktigt att hålla passagenumret i åtanke eftersom cellinjer kan ändras vid utökad odling som leder till förändring av uttrycksprofiler. Således är det viktigt att frysa många celllager vid tidiga passager. Cellerna ska frysas i 10% DMSO och 90% NPC-media och lagras långsiktigt i flytande kväve. På grund av bristen på serum i detta medium är det viktigt att säkerställa en långsam frysning med fryskammare och när den har frusit över natten, överför omedelbart till flytande kväve. Även om inget klonurvalet utförs i detta protokoll, är det möjligt att utökad odling och passaging leder till naturligt urval av en initial cellpopulation med gynnsam tillväxt och överlevnad. Därför är det viktigt att hålla passagenummer och hantering i åtanke när du utför experiment. Vi föredrar att använda lägre passager för experiment, om möjligt överskrider vi inte passande cellinjerna mer än 20 gånger. Eftersom nödlidande lån växer snabbt kan ett stort antal lager frysas vid lägre passager för experiment. Cellinjer med särskilt hög tillväxttakt har högre risk för medieförsurning. I takt med att cellinjerna växer med olika hastighet kan mängden media behöva justeras baserat på spridning. Om cellerna kontinuerligt lämnas i mycket surgjorda medier kan det påverka hälsan hos både kontroll- och sjukdomscelllinjer. Detta orsakar även friska astrocyter att bli reaktiva, vilket påverkar deras användning i ytterligare differentiering och experiment.
För astrocyt differentiering är det viktigt att hålla cellerna med låg densitet eftersom hög densitet kommer att förhindra att cellerna differentierar och de kommer att fortsätta att sprida sig i högre takt. Således måste såddtätheten justeras för varje cellinje som är beroende av deras spridningshastighet. Vi rekommenderar att du provar olika såddtätheter och utför färgningar/RT-PCR med astrocytmarkörer för att säkerställa korrekt differentiering. IAs kvalitet kan bedömas tillsammans med friska kontroller med hjälp av co-culture analyser med nervceller. Förutsatt att sjukdom patologi inte leder till en reaktiv fenotyp, nervceller bör förbli livskraftiga i kontakt med iAs i flera dagar. Astrocyt morfologi kan variera kraftigt mellan enskilda cellinjer och kan påverkas av sjukdomen fenotyp samt. Dessutom, i sjukdomar där astrocyter påverkas kraftigt, kan de visa en reaktiv fenotyp med stora, långsträckta förlängningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla patienter och friska frivilliga för att de donerat kritiska prover till forskningsstudier. Dessutom tackar vi Rochelle Rodrigo för kontinuerlig teknisk hjälp inom vävnadskultur och Laura Ferraiuolo för att självständigt ha bekräftat tekniken i hennes labb som samarbetspartner. Detta arbete fick finansiering från US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 och RC2 NS69476-01 (till A.L.S.) och Packard Center for ALS Research Grant P2ALS och Helping Link Foundation. K.M. fick också finansiering från Swiss National Science Foundation samt Young Investigator Development Award från Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust och familjerna till SCN2A-stiftelserna.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |