सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के साथ डीएनए हेलो तैयारी का संयोजन न्यूक्लियोस्केलेटन के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम बनाता है। संलग्न जीनोम अवशिष्ट निकाले गए नाभिक के भीतर स्थित संकरित फ्लोरोसेंट संकेतों की ओर जाता है, जबकि गैर-संलग्न जीनोम अवशिष्ट नाभिक के आसपास डीएनए के प्रभामंडल में होता है।
जीनोम सेल नाभिक के अंदर कई संरचनाओं से जुड़ा हुआ है, ताकि इसकी गतिविधि को विनियमित किया जा सके और इसे विशिष्ट स्थानों में लंगर डाला जा सके। इन संरचनाओं को सामूहिक रूप से न्यूक्लियोस्केलेटन के रूप में जाना जाता है और इसमें परमाणु लैमिना, न्यूक्लियोली और परमाणु निकाय शामिल हैं। यद्यपि जीनोम और उसके संगठन का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) के कई प्रकार मौजूद हैं, ये अक्सर संकल्प द्वारा सीमित होते हैं और परमाणु संरचनाओं के साथ जीनोम के संबंध पर अपर्याप्त जानकारी प्रदान करते हैं। डीएनए हेलो विधि डीएनए लूप उत्पन्न करने के लिए उच्च नमक सांद्रता और गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग करती है जो जीनोम के भीतर अनुलग्नक क्षेत्रों के माध्यम से नाभिक के भीतर संरचनाओं में लंगर डालती है। यहां, घुलनशील परमाणु प्रोटीन, जैसे हिस्टोन, लिपिड और डीएनए परमाणु मैट्रिक्स से कसकर बंधे नहीं होते हैं, निकाले जाते हैं। यह एक अवशिष्ट नाभिक के आसपास असंबद्ध डीएनए के प्रभामंडल के गठन की ओर जाता है जिसमें स्वयं आंतरिक परमाणु संरचनाओं और निष्कर्षण प्रतिरोधी प्रोटीन के साथ निकटता से जुड़े डीएनए होते हैं। ये विस्तारित डीएनए किस्में बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन को सक्षम करती हैं और भौतिक मानचित्रण की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। फिश के साथ संयोजन में, इस विधि में उन सभी संरचनाओं के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन का अध्ययन करने का अतिरिक्त लाभ है जो जीनोम द्वारा लंगर डाला जाता है। यह तकनीक, जिसे हेलो-फिश कहा जाता है, अत्यधिक बहुमुखी है जिससे डीएनए हेलो को जीन लोकी, पूरे गुणसूत्र, अल्फा उपग्रह, टेलोमेरेस और यहां तक कि आरएनए को प्रकट करने के लिए न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ जोड़ा जा सकता है। यह तकनीक परमाणु संगठन और सामान्य कोशिकाओं में और कैंसर जैसे रोग की प्रगति में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
“परमाणु मैट्रिक्स” को पहली बार 1974 में बेरेज़नी और कॉफी द्वारा वर्णित किया गयाथा। चूहे के यकृत नाभिक पर उच्च नमक दाढ़ और न्यूक्लियस उपचार के साथ निष्कर्षण करने के बाद, उन्होंने एक प्रोटीनयुक्त संरचनात्मक ढांचे की पहचान की। डीएनए हेलो प्रक्रिया को बाद में इस विधि से अनुकूलित किया गया था और इसमें घुलनशील प्रोटीन को हटाना शामिल है ताकि केवल परमाणु मैट्रिक्स (एनएम) और एनएम से जुड़े प्रोटीन और गुणसूत्र बने रहें। डीएनए अनुलग्नक क्षेत्र डीएनए लूप के आधार पर स्थित होते हैं और उन्हें मैट्रिक्स संलग्न क्षेत्र (एमएआर) या पाड़ अनुलग्नक क्षेत्र (एसएआर) कहा जाता है, जो क्रमशः उच्च नमक सांद्रता और आयनिक डिटर्जेंट लिथियम -3,5-डायियोडोसैलिसिलेट (एलआईएस) के साथ निष्कर्षण के लिए प्रतिरोधी होते हैं। डीएनए प्रभामंडल में, एमएआर / एसएआर से जुड़े डीएनए अवशिष्ट नाभिक के भीतर बंधे होते हैं जबकि डीएनए लूप इन साइटों से दूर होते हैं और डीएनए प्रभामंडल बनाते हैं। अब हम जानते हैं कि जीनोम को लैमिना से जुड़े डोमेन (एलएडी) के माध्यम से परमाणु लैमिना और न्यूक्लियोलर संबद्ध क्षेत्रों (एनएडी) के माध्यम से और संभवतः विशिष्ट परमाणु निकायों जैसे अन्य परमाणु संरचनाओं के माध्यम से लंगर डाला जाता है।
डीएनए हेलो विधि का उपयोग डीएनए, जीन और क्रोमोसोमल क्षेत्रों के भौतिक मानचित्रण के लिए किया जा सकता है क्योंकि विस्तारित डीएनए और क्रोमैटिन एक अधिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है क्योंकि क्रोमैटिन को हिस्टोन से छीन लिया जाता है और डीएनए 2,3,4,5,6 तक फैला होता है। हालांकि, इस आवेदन के लिए डीएनए हेलो का उपयोग करते समय कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए प्रभामंडल के अवशिष्ट नाभिक के साथ कसकर जुड़े डीएनए जांच के लिए दुर्गम हो सकते हैं, इस प्रकार इसे विश्लेषण और भौतिक मानचित्रण से अलग किया जा सकताहै। फाइबर-फिश 2,4,5,7 और आणविक कॉम्बिंग 8 जैसी अन्य तकनीकें भी भौतिक मानचित्रण को सक्षम करती हैं और अपेक्षाकृत तेज और प्रदर्शन करने में आसान होने का लाभ रखती हैं। दोनों अधिमानतः डीएनए प्रभामंडल पर जीन के डीएनए मानचित्रण के लिए उपयोग किए जाते हैं। ये विधियां नाभिक से विलायक या नमक निष्कर्षण के उपयोग के माध्यम से क्रोमैटिन फाइबर निकालती हैं, हालांकि, आणविक कंघी में बेहतर प्रजनन क्षमता 8,9 होती है।
एक बढ़ते सबूत हैं कि न्यूक्लियोस्केलेटन की प्रमुख परमाणु प्रक्रियाओं का समर्थन करने में भूमिका है, जैसे कि डीएनए, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग, डीएनए ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए मरम्मत और डीएनए प्रतिकृति11,12 के लिए अनुलग्नक साइटें। जैसे, डीएनए हेलो तकनीक इन सेलुलर गतिविधियों के दौरान न्यूक्लियोस्केलेटन और जीनोम के बीच बातचीत की जांच करने के लिए विकसित की गई थी और अनुसंधान में नियमित रूप से उपयोग और रिपोर्ट की गई है। इस तकनीक का उपयोग परमाणु संरचना में घातकता से जुड़े परिवर्तनों के साथ रोग की प्रगति के संबंध में जीनोम और न्यूक्लियोस्केलेटन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए भी किया गयाहै।
विकास और भेदभाव12 के दौरान जीनोम और न्यूक्लियोस्केलेटन के बीच संबंधों की जांच करने के लिए डीएनए हेलो तकनीक का भी उपयोग किया गया है। कई अध्ययनों ने डीएनए हेलो तकनीक की भिन्नता का उपयोग किया है जिसे हेलोस्पर्म13 या स्पर्महेलो-फिश के रूप में जाना जाता है यदि फिश14 के साथ युग्मित किया जाता है। शुक्राणुक्रोमैटिन प्रोटीन से कसकर बंधा होता है जिसे प्रोटामाइन कहा जाता है और इस तकनीक को शुक्राणु डीएनए तक पहुंच में सुधार के लिए विकसित किया गया था। हेलोस्पर्म का उपयोग शुक्राणुडीएनए की अखंडता की जांच करने और यह निर्धारित करने के लिए किया गया है कि डीएनए क्षति मौजूद है या नहीं। कम डीएनए क्षति वाले शुक्राणु एक बड़े डीएनए प्रभामंडल के आकार से संबंधित होते हैं, जबकि खंडित और क्षतिग्रस्त डीएनए के बढ़े हुए स्तर वाले शुक्राणुओं में या तो छोटे प्रभामंडल होते हैं या कोई भी नहीं होता है। इस प्रकार, हेलोस्पर्म का उपयोग आईवीएफ13 के साथ भ्रूण की गुणवत्ता और सफल गर्भावस्था के संभावित रोगसूचक मार्कर के रूप में किया जा सकता है। यह उदाहरण इस तकनीक के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों पर जोर देता है। हमारे काम में हमने जीनोम व्यवहार में परिवर्तन और समय से पहले उम्र बढ़ने की बीमारी हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम (एचजीपीएस) 15 में विशिष्ट दवा उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए हेलो-फिश का उपयोग किया है।
साथ में, और अन्य अध्ययन, प्रक्रियाओं / अनुप्रयोगों की चौड़ाई को उजागर करते हैं जो डीएनए हेलो तकनीक का उपयोग तकनीक के अध्ययन और उपयोगिता के लिए किया जा सकता है।
न्यूक्लियोस्केलेटन और जीनोम के बीच बातचीत का विश्लेषण करते समय डीएनए हेलो विधि पसंद की एक उत्कृष्ट विधि है, हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका पालन भी किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक सेल सीडिंग घनत्व का अनुकूलन है। यदि कोशिकाएं अधिक संकुचित हो जाती हैं, तो डीएनए प्रभामंडल पड़ोसी कोशिकाओं के साथ ओवरलैप हो जाएगा जिससे विश्लेषण करना असंभव हो जाएगा। सीएसके और निष्कर्षण बफर को हमेशा उपयोग के दिन ताजा बनाया जाना चाहिए, जिसमें उनकी जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए तैयारी प्रक्रिया के अंत में निष्कर्षण बफर में शुक्राणु, स्पर्मिडाइन और डिजिटोनिन जोड़ा जाता है। यदि हेलो-फिश का प्रदर्शन किया जाता है, तो डीएनए प्रभामंडल के सही विकृतीकरण तापमान का उपयोग करना बेहद महत्वपूर्ण है ताकि जांच या पेंट को बाद में संकरण करने में सक्षम बनाया जा सके।
परमाणु मैट्रिक्स की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है, जिसमें फिलामेंटस संरचनाओं की पहचानकी जा रही है। हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सीमित है क्योंकि क्रोमैटिन के साथ मैट्रिक्स एसोसिएशन आसानी से अनुमान नहीं लगाया जा सकता है। दरअसल, डीएनए हेलो विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक बहुमुखी है क्योंकि विशिष्ट जीन, गुणसूत्र और सेल राज्यों की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, परमाणु मैट्रिक्स प्रोटीन के प्रोटिओमिक विश्लेषण का अध्ययन किया जा रहाहै21,22। यह विधि परमाणु मैट्रिक्स घटकों की तुलना करने के लिए अच्छी है, खासकर जब रोगग्रस्त कोशिकाओं की तुलना की जाती है, हालांकि, यह मानक डीएनए हेलो तकनीक द्वारा हाइलाइट किए गए स्थानिक वितरण और अनुलग्नक प्रदान नहीं करता है।
डीएनए हेलो परख की सीमाएं हैं। सबसे पहले, जैसा कि मैट्रिक्स निकाला जाता है, यह केवल निश्चित कोशिकाओं पर किया जा सकता है इसलिए लाइव इमेजिंग संभव नहीं है। यद्यपि डीएनए हेलो विधि अपेक्षाकृत तेज और प्रदर्शन करने में आसान है, लेकिन समग्र प्रक्रिया में समय लग सकता है जब सेल कल्चर, जांच पीढ़ी, हेलो-फिश और विश्लेषण सभी को ध्यान में रखा जाता है।
सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीएनए हेलोस और हेलो-फिश की छवि कैप्चर डीएनए विशिष्ट जांच और एंटीबॉडी के रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार करेगी। इसके अलावा, जैसा कि फ्लोरोक्रोम को अधिक आसानी से वर्णक्रमीय रूप से हल किया जा सकता है, एक ही प्रयोग में कई डीएनए जांच का उपयोग करना संभव हो सकता है, जो और भी अधिक जानकारी प्रदान करता है। आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में सुधार जैसे क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) का उपयोग जीन लोकी की बातचीत को निर्धारित करने और सेल में क्रोमैटिन पर स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। डीएनए हेलो परख और 3 सी को जोड़ा जा सकता है, एक शब्द जिसे एम 3 सी23 के रूप में जाना जाता है, फिर से डीएनए हेलो तकनीक की अनुकूलनशीलता का प्रदर्शन करता है।
यहां प्रस्तुत मूल डेटा जीनोम व्यवहार पूछताछ के लिए संभावनाओं को प्रदर्शित करने और उन डेटा को प्रस्तुत करने के तरीके को प्रदर्शित करने के लिए है। इन आंकड़ों के साथ हमने प्रदर्शित किया है कि (1) क्रोमोसोम पेंटिंग जांच का उपयोग करके जीनोम अनुलग्नक में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करना संभव है, इस अध्ययन में गुणसूत्र 18 का विश्लेषण किए गए लोगों में से सबसे कम संलग्न गुणसूत्र है (चित्रा 3); (2) दो जीन लोकी और (चित्रा 4) (3) टेलोमेरेस के बीच महत्वपूर्ण अंतर के साथ जीन लोकी, जो प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं की तुलना में क्विसेंट कोशिकाओं में कम दृढ़ता से जुड़े होते हैं (चित्रा 5)। हम प्रसार मार्कर Ki67 एंटीजन की उपस्थिति के माध्यम से प्रसार और गैर-प्रसार कोशिकाओं के बीच अंतर करने में सक्षम हैं, जो एक अघुलनशील प्रोटीन है, इसलिए अवशिष्ट नाभिक के साथ रहता है या एक विशिष्ट समय अवधि के भीतर एस-चरण के माध्यम से होने वाली कोशिकाओं को उजागर करने के लिए न्यूक्लियोटाइड के समावेश का उपयोग करता है (चित्रा 2)। इस तकनीक ने हमें उन कोशिकाओं में जीनोम व्यवहार का विश्लेषण करने में भी सक्षम बनाया है जो अपने न्यूक्लियोस्केलेटन यानी लैमिनोपैथी कोशिकाओं में समझौता करते हैं और यहां और बिकुल एट अल, 2018 में हम प्रकट करते हैं कि नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में जीनोम को कम कसकर जोड़ा जा सकता है और विशिष्ट दवाओं के साथ इलाज करते समय बहाल किया जा सकता है जो शास्त्रीय एचजीपीएसकोशिकाओं में लैमिन ए उत्परिवर्तन के प्रभाव को सुधारते हैं।. हालांकि, हम यहां एटिपिकल एचजीपीएस एजीओ 8466 कोशिकाओं के लिए नए डेटा दिखाते हैं, जिसमें लैमिन ए उत्परिवर्तन की कमी होती है, लेकिन एलआईएनसी कॉम्प्लेक्स प्रोटीन सन 119 का एक असामान्य रूप होता है जिसमें क्रोमोसोम 13 कम कसकर जुड़ा होता है (चित्रा 6)।
हेलो-फिश निष्कर्षण प्रक्रिया से हटाए गए प्रोटीन को हल करने के लिए अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संयोजन में न्यूक्लियोस्केलेटन के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम करके एक अनूठी विधि है। यह प्रदर्शित किया गया है कि न्यूक्लियोस्केलेटन को विभिन्न बीमारियों में संशोधित किया जाता है जैसे कि कुछ कैंसरप्रकार 19 और नैदानिक बायोमार्कर24,25 के रूप में कुछ न्यूक्लियोस्केलेटन से जुड़े प्रोटीन का महत्व। इस प्रकार, रोग15,24,25,27 में क्रोमैटिन संगठन / विघटन पर न्यूक्लियोस्केलेटन के प्रभाव की जांच करने में इस तकनीक की महत्वपूर्ण भूमिका है और यह मानव कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है, अन्य जानवरों से क्रोमोसोमल पेंटिंग जांच के साथ, एक ही डीएनए-हेलोप्रोटोकॉल को नियोजित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम क्रोमोसोम आर्म पेंटिंग जांच के उपहार के लिए प्रोफेसर माइकल बिटनर को धन्यवाद देना चाहते हैं। एलजी को यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित यूरो-लैमिनोपैथिस परियोजना और ब्रुनेल प्रोजेरिया रिसर्च फंड द्वारा समर्थित किया गया था।
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |