A combinação de preparações de halo de DNA com hibridização in situ fluorescente permite a análise de alta resolução das interações genômicas com o nucleoesqueleto. O genoma anexado leva a sinais fluorescentes hibridizados localizados dentro dos núcleos residuais extraídos, enquanto o genoma não ligado está no halo de DNA ao redor dos núcleos residuais.
O genoma está associado a várias estruturas dentro dos núcleos celulares, a fim de regular sua atividade e ancorá-lo em locais específicos. Essas estruturas são coletivamente conhecidas como nucleoesqueleto e incluem a lâmina nuclear, os nucléolos e os corpos nucleares. Embora muitas variantes de hibridação in situ fluorescente (FISH) existam para estudar o genoma e sua organização, estas são frequentemente limitadas pela resolução e fornecem informações insuficientes sobre a associação do genoma com estruturas nucleares. O método do halo de DNA usa altas concentrações de sal e detergentes não iônicos para gerar alças de DNA que permanecem ancoradas a estruturas dentro dos núcleos através de regiões de ligação dentro do genoma. Aqui, proteínas nucleares solúveis, como histonas, lipídios e DNA não fortemente ligados à matriz nuclear, são extraídas. Isso leva à formação de um halo de DNA não anexado ao redor de um núcleo residual que contém DNA intimamente associado a estruturas nucleares internas e proteínas resistentes à extração. Essas cadeias de DNA estendidas permitem maior resolução e podem facilitar o mapeamento físico. Em combinação com FISH, este método tem a vantagem adicional de estudar interações genômicas com todas as estruturas pelas quais o genoma está ancorado. Esta técnica, denominada HALO-FISH, é altamente versátil, pela qual halos de DNA podem ser acoplados a sondas de ácido nucleico para revelar loci gênicos, cromossomos inteiros, satélite alfa, telômeros e até RNA. Esta técnica fornece uma visão sobre a organização nuclear e função em células normais e na progressão de doenças, como no câncer.
A “matriz nuclear” foi descrita pela primeira vez por Berezney e Coffey em 19741. Após realizarem extrações com altas molaridades salinas e tratamento com nucleases em núcleos hepáticos de ratos, eles identificaram um arcabouço estrutural proteico. O procedimento do halo de DNA foi posteriormente adaptado deste método e envolve a remoção de proteínas solúveis para que apenas a matriz nuclear (NM) e as proteínas e cromossomos associados à MN persistam. As regiões de ligação ao DNA estão localizadas na base das alças de DNA e são chamadas de regiões ligadas à matriz (MARs) ou regiões de ligação do andaime (SARs), que são resistentes à extração com altas concentrações de sal e detergente iônico lítio-3,5-diiodossalicilato (LIS), respectivamente. Nos halos de DNA, o DNA associado a MARs/SARs está ligado dentro do núcleo residual, enquanto as alças de DNA se estendem para longe desses locais e formam o halo de DNA. Sabemos agora que o genoma está ancorado via domínios associados à lâmina (LADs) à lâmina nuclear e através de regiões nucleolares associadas (NADs) e possivelmente através de outras estruturas nucleares, como corpos nucleares específicos.
O método do halo de DNA pode ser utilizado para mapeamento físico de DNA, genes e regiões cromossômicas, pois o DNA estendido e a cromatina proporcionam maior resolução, pois a cromatina é despida de histonas e o DNA é estirado 2,3,4,5,6. No entanto, existem algumas limitações ao usar halos de DNA para esta aplicação. Por exemplo, o DNA fortemente associado a núcleos residuais de halos de DNA pode ser inacessível às sondas, impedindo-o de análise e mapeamento físico6. Outras técnicas como a fibra-FISH 2,4,5,7 e o pente molecular 8 também possibilitam o mapeamento físico e têm a vantagem de serem relativamente rápidas e fáceis de serem realizadas. Ambos são preferencialmente usados para mapeamento de DNA de genes sobre halos de DNA. Esses métodos extraem fibras de cromatina através do uso de extrações com solvente ou sal do núcleo, entretanto, o penteamento molecular tende a ter melhor reprodutibilidade8,9.
Há evidências crescentes de que o nucleoesqueleto tem um papel no suporte de processos nucleares chave, tais como sítios de ligação para o DNA, remodelamento da cromatina, transcrição do DNA, reparo do DNA e replicação do DNA11,12. Como tal, a técnica do halo de DNA foi desenvolvida para investigar as interações entre o nucleoesqueleto e o genoma durante essas atividades celulares e tem sido rotineiramente usada e relatada em pesquisas. Essa técnica também tem sido utilizada para investigar interações entre o genoma e o nucleoesqueleto em relação à progressão da doença, sendo identificadas alterações na estrutura nuclear associadas àmalignidade11.
A técnica do halo de DNA também tem sido utilizada para investigar a relação entre o genoma e o nucleoesqueleto durante o desenvolvimento ediferenciação12. Vários estudos têm utilizado uma variação da técnica do halo de DNA conhecida como halosperma13 ou SpermHalo-FISH se acoplada à FISH14. A cromatina dos espermatozoides está firmemente ligada a proteínas conhecidas como protaminas e esta técnica foi desenvolvida para melhorar o acesso ao ADN dos espermatozoides. Halosperma tem sido usada para investigar a integridade do DNA dos espermatozoides e determinar se danos ao DNA estão presentes. Os espermatozoides com menos danos ao DNA correlacionam-se a um maior tamanho do halo de DNA, enquanto os espermatozoides com níveis aumentados de DNA fragmentado e danificado tinham halos pequenos ou nenhum. Assim, a halosperma pode ser utilizada como um potencial marcador prognóstico da qualidade embrionária e do sucesso da gestação com FIV13. Este exemplo enfatiza as potenciais aplicações clínicas dessa técnica. Em nosso trabalho utilizamos HALO-FISH para avaliar mudanças no comportamento do genoma e o efeito de tratamentos medicamentosos específicos na doença do envelhecimento precoce Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (HGPS)15.
Juntos, esses e outros estudos destacam a amplitude de processos/aplicações que a técnica do halo de DNA pode ser utilizada para estudar e a utilidade da técnica.
O método do halo de DNA é um excelente método de escolha para analisar interações entre o nucleoesqueleto e o genoma, no entanto, existem algumas etapas críticas que também devem ser seguidas. Um dos parâmetros mais importantes é a otimização da densidade de semeadura celular. Se as células se tornarem mais confluentes, os halos de DNA se sobreporão às células vizinhas, impossibilitando a realização da análise. Os tampões CSK e de extracção devem ser sempre renovados no dia da utilização, com espermina, espermidina e digitonina a serem adicionadas ao tampão de extracção no final do processo de preparação para manter a sua actividade biológica. Ao realizar Halo-FISH, é extremamente importante usar a temperatura de desnaturação correta dos halos de DNA para permitir que a sonda ou tinta hibridize posteriormente.
A microscopia eletrônica tem sido utilizada para visualizar a matriz nuclear, sendo identificadas estruturasfilamentosas20. No entanto, a microscopia eletrônica é limitada, pois associações de matriz com cromatina não podem ser facilmente deduzidas. De fato, o método de DNA Halo é mais versátil em comparação com a microscopia eletrônica, pois genes, cromossomos e estados celulares específicos podem ser examinados. Além disso, a análise proteômica de proteínas da matriz nuclear está sendo estudada21,22. Este método é bom para comparar componentes da matriz nuclear, particularmente quando se compara células doentes, no entanto, não fornece a distribuição espacial e os anexos destacados pela técnica padrão de DNA Halo.
Os ensaios de DNA Halo têm limitações. Em primeiro lugar, como a matriz é extraída, isso só pode ser realizado em células fixas, de modo que imagens vivas não são possíveis. Embora o método de Halo de DNA seja relativamente rápido e fácil de executar, o processo geral pode ser demorado quando a cultura de células, a geração de sonda, o Halo-FISH e a análise são levados em consideração.
A captura de imagens de Halos de DNA e HALO-FISH usando microscopia de super-resolução melhoraria muito a resolução de sondas e anticorpos específicos de DNA. Além disso, como os fluorocromos podem ser mais facilmente resolvidos espectralmente, pode ser possível usar várias sondas de DNA em um único experimento, fornecendo ainda mais informações. Melhorias em técnicas de biologia molecular, como a captura de conformação cromossômica (3C), têm sido usadas para determinar interações de loci gênicos e analisar a organização espacial da cromatina na célula. Ensaios de DNA Halo e 3C podem ser combinados, um termo conhecido como M3C23, demonstrando novamente a adaptabilidade da técnica de DNA Halo.
Os dados originais aqui apresentados são para demonstrar as possibilidades de interrogação do comportamento genômico e como apresentar esses dados. Com esses dados demonstramos que é possível determinar diferenças significativas na ligação genômica utilizando (1) sondas de pintura cromossômica, neste estudo revelando que o cromossomo 18 é o menos aderido dentre os analisados (Figura 3); (2) Loci gênicos com diferenças significativas entre dois loci gênicos e (Figura 4) (3) Telômeros, que estão menos fortemente aderidos em células quiescentes em comparação com células em proliferação e senescentes (Figura 5). Podemos diferenciar células em proliferação e não proliferantes através da presença do marcador de proliferação Ki67 antígeno que é uma proteína insolúvel assim permanece com os núcleos residuais ou usando a incorporação de nucleotídeos para destacar células que passaram pela fase S dentro de um período de tempo específico (Figura 2). Essa técnica também nos permitiu analisar o comportamento do genoma em células que estão comprometidas em seus nucleoesqueletos, ou seja, células de laminopatia e aqui e em Bikkul et al., 2018 revelamos que o genoma pode ser menos firmemente ligado quando comparado às células controle e pode ser restaurado quando tratado com drogas específicas que amenizam o efeito da mutação da lamina A em células HGPS clássicas15. No entanto, mostramos novos dados aqui para as células atípicas HGPS AGO8466, sem mutação na lamina A, mas contendo uma forma incomum da proteína do complexo LINC SUN1 19 na qual o cromossomo13 está menos firmemente ligado (Figura 6).
HALO-FISH é um método único por permitir o estudo de interações genômicas com o nucleoesqueleto em combinação com imunofluorescência indireta para resolver proteínas não removidas do procedimento de extração. Tem sido demonstrado que o nucleoesqueleto é modificado em várias doenças, como certos tipos de câncer19 e a importância de algumas proteínas associadas ao nucleoesqueleto como biomarcadoresdiagnósticos 24,25. Assim, essa técnica tem um papel importante no exame do efeito do nucleoesqueleto na organização/desorganização da cromatina na doença 15,24,25,27 e não se restringe às células humanas, com sondas de pintura cromossômica de outros animais, o mesmo protocolo DNA-halo poderia ser empregado 28.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Prof. Michael Bittner pelo gentil presente das sondas de pintura de braço cromossômico. A LG foi apoiada pelo projeto EURO-Laminopathies financiado pela UE e pelo Brunel Progeria Research Fund.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |