Merking og visualisering av mitokondriegenomuttrykksprodukter i Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Bakers gjær mitokondrie genom koder åtte polypeptider. Målet med den nåværende protokollen er å merke dem alle og deretter visualisere dem som separate bånd.

Abstract

Mitokondrier er essensielle organeller av eukaryotiske celler som er i stand til aerob åndedrett. De inneholder sirkulært genom- og genuttrykksapparat. Et mitokondriegenom av bakerens gjær koder åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med metoden som er beskrevet her er å spesifikt merke disse proteinene ^{med 35}S metionin, skille dem ved elektroforese og visualisere signalene som diskrete bånd på skjermen. Prosedyren innebærer flere trinn. For det første dyrkes gjærceller i et galaktoseholdig medium til de når det sene logaritmiske vekststadiet. Deretter blokkerer cykloheximid behandling cytoplasmatisk oversettelse og tillater ³⁵S metioninininkorporering bare i mitokondrieoversettelsesprodukter. Deretter ekstraheres alle proteiner fra gjærceller og separeres av polyakrylamid gelelektroforese. Til slutt tørkes gelen og inkuberes med lagringsfosforskjermen. Skjermen skannes på en fosforer som avslører båndene. Metoden kan brukes til å sammenligne biosyntesehastigheten til et enkelt polypeptid i mitokondriene til en mutert gjærstamme kontra villtypen, noe som er nyttig for å studere mitokondriegenuttrykksfeil. Denne protokollen gir verdifull informasjon om oversettelseshastigheten til alle gjær mitokondrie mRNAs. Det krever imidlertid flere kontroller og flere eksperimenter for å gjøre riktige konklusjoner.

Introduction

Mitokondrier er organeller dypt involvert i metabolismen av en eukaryotisk celle. Deres elektronoverføringskjede forsyner cellen med ATP, den viktigste energiske valutaen som brukes i flere biokjemiske veier. Dessuten er de involvert i apoptose, fettsyre og heme syntese, og andre prosesser. Dysfunksjon av mitokondrier er en velkjent kilde til menneskelig sykdom¹. Det kan skyldes mutasjoner i kjernefysiske eller mitokondriegener som koder strukturelle eller regulatoriske komponenter i organeller². Bakers gjær Saccharomyces cerevisiae er en utmerket modell organisme for å studere mitokondriegenuttrykk på grunn av flere grunner. For det første er genomet deres fullstendig^{sekvensert 3}, godt kommentert, og en stor sum data er allerede tilgjengelig i litteraturen takket være den lange historien med undersøkelser utført med denne organismen. For det andre er manipulasjonene med deres kjernefysiske genom relativt raske og enkle på grunn av deres raske vekstrate og svært effektive homologe rekombinasjonssystem. For det tredje er bakerens gjær S. cerevisiae en av de få organismene som manipulasjonene med mitokondriegenomer utvikles for. Til slutt er bakerens gjær en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillater isolasjon og studie av respiratoriske defekte mutanter, siden de kan vokse i medier som inneholder fermenterbare karbonkilder.

Vi beskriver metoden for å studere mitokondriegenuttrykk av bakergjær S. cerevisiae på translasjonelt nivå⁴. Hovedprinsippet kommer fra flere observasjoner. Først koder gjær mitokondriegenomet bare åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p⁵. Dette nummeret er lite, og alle kan skilles av elektroforese på en enkelt gel under de aktuelle forholdene. For det andre tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryotiske klassen i stedet for eukaryotisk⁶, og derfor er følsomheten for antibiotika forskjellig for gjær cytoplasmatiske og mitokondrie ribosomer. Det tillater hemming av cytoplasmatisk oversettelse med cykloheximid, noe som gir forholdene når den merkede aminosyren (³⁵S-metionin) bare innlemmes i mitokondrieoversettelsesprodukter. Som et resultat gir eksperimentet informasjon om frekvensen av aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetisert de novo, noe som gjenspeiler den generelle effektiviteten av mitokondrieoversettelse for hvert av de åtte produktene

Protocol

1. Gjær kultur forberedelse Strek gjær fra de frosne lagerkulturene på ferske plater med riktig medium. Sett platene i en kultur inkubator ved 30 °C i 24–48 timer.MERK: La de temperaturfølsomme mutantene vokse ved den tillatte temperaturen. Inokuler gjærkulturer i 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gjærekstrakt, 2% galaktose) fra den friske streken i 15 ml rør og inkubere dem over natten agitating ved 200 rpm ved 30 ° C. Mål den optiske tettheten av kulturen med en bølgelengde…

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor, tildelte vi mitokondrieoversettelsesprodukter fra to S. cerevisiae stammer: vill type (WT) og en mutert lagersletting av AIM23 genet (AIM23Δ),koding mitokondrie oversettelse initiering faktor 3 (Tabell 1)8. Mitokondrieoversettelsesprodukter ble radioaktivt merket og separert i SDS-PAAG9. Prøvene ble samlet inn hver 2,5 min før metning for å bygge et tidskurs (figur 1A). Gelen…

Discussion

Undersøkelser av genuttrykk opptar en sentral rolle i moderne biovitenskap. Mange metoder som gir innsikt i denne komplekse prosessen er utviklet. Her beskrev vi metoden som tillater tilgang til proteinbiosyntese i bakerens gjær S. cerevisiae mitokondrier. Det brukes vanligvis til å sammenligne oversettelseseffektivitet av mRNAs i mitokondrier av mutert gjærstamme versus vill type for å få tilgang til konsekvensene av den studerte mutasjonen. Dette er et av de grunnleggende eksperimentene forskerne utføre…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625