Bakers gjær mitokondrie genom koder åtte polypeptider. Målet med den nåværende protokollen er å merke dem alle og deretter visualisere dem som separate bånd.
Mitokondrier er essensielle organeller av eukaryotiske celler som er i stand til aerob åndedrett. De inneholder sirkulært genom- og genuttrykksapparat. Et mitokondriegenom av bakerens gjær koder åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med metoden som er beskrevet her er å spesifikt merke disse proteinene med 35S metionin, skille dem ved elektroforese og visualisere signalene som diskrete bånd på skjermen. Prosedyren innebærer flere trinn. For det første dyrkes gjærceller i et galaktoseholdig medium til de når det sene logaritmiske vekststadiet. Deretter blokkerer cykloheximid behandling cytoplasmatisk oversettelse og tillater 35S metioninininkorporering bare i mitokondrieoversettelsesprodukter. Deretter ekstraheres alle proteiner fra gjærceller og separeres av polyakrylamid gelelektroforese. Til slutt tørkes gelen og inkuberes med lagringsfosforskjermen. Skjermen skannes på en fosforer som avslører båndene. Metoden kan brukes til å sammenligne biosyntesehastigheten til et enkelt polypeptid i mitokondriene til en mutert gjærstamme kontra villtypen, noe som er nyttig for å studere mitokondriegenuttrykksfeil. Denne protokollen gir verdifull informasjon om oversettelseshastigheten til alle gjær mitokondrie mRNAs. Det krever imidlertid flere kontroller og flere eksperimenter for å gjøre riktige konklusjoner.
Mitokondrier er organeller dypt involvert i metabolismen av en eukaryotisk celle. Deres elektronoverføringskjede forsyner cellen med ATP, den viktigste energiske valutaen som brukes i flere biokjemiske veier. Dessuten er de involvert i apoptose, fettsyre og heme syntese, og andre prosesser. Dysfunksjon av mitokondrier er en velkjent kilde til menneskelig sykdom1. Det kan skyldes mutasjoner i kjernefysiske eller mitokondriegener som koder strukturelle eller regulatoriske komponenter i organeller2. Bakers gjær Saccharomyces cerevisiae er en utmerket modell organisme for å studere mitokondriegenuttrykk på grunn av flere grunner. For det første er genomet deres fullstendigsekvensert 3, godt kommentert, og en stor sum data er allerede tilgjengelig i litteraturen takket være den lange historien med undersøkelser utført med denne organismen. For det andre er manipulasjonene med deres kjernefysiske genom relativt raske og enkle på grunn av deres raske vekstrate og svært effektive homologe rekombinasjonssystem. For det tredje er bakerens gjær S. cerevisiae en av de få organismene som manipulasjonene med mitokondriegenomer utvikles for. Til slutt er bakerens gjær en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillater isolasjon og studie av respiratoriske defekte mutanter, siden de kan vokse i medier som inneholder fermenterbare karbonkilder.
Vi beskriver metoden for å studere mitokondriegenuttrykk av bakergjær S. cerevisiae på translasjonelt nivå4. Hovedprinsippet kommer fra flere observasjoner. Først koder gjær mitokondriegenomet bare åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p5. Dette nummeret er lite, og alle kan skilles av elektroforese på en enkelt gel under de aktuelle forholdene. For det andre tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryotiske klassen i stedet for eukaryotisk6, og derfor er følsomheten for antibiotika forskjellig for gjær cytoplasmatiske og mitokondrie ribosomer. Det tillater hemming av cytoplasmatisk oversettelse med cykloheximid, noe som gir forholdene når den merkede aminosyren (35S-metionin) bare innlemmes i mitokondrieoversettelsesprodukter. Som et resultat gir eksperimentet informasjon om frekvensen av aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetisert de novo, noe som gjenspeiler den generelle effektiviteten av mitokondrieoversettelse for hvert av de åtte produktene
Undersøkelser av genuttrykk opptar en sentral rolle i moderne biovitenskap. Mange metoder som gir innsikt i denne komplekse prosessen er utviklet. Her beskrev vi metoden som tillater tilgang til proteinbiosyntese i bakerens gjær S. cerevisiae mitokondrier. Det brukes vanligvis til å sammenligne oversettelseseffektivitet av mRNAs i mitokondrier av mutert gjærstamme versus vill type for å få tilgang til konsekvensene av den studerte mutasjonen. Dette er et av de grunnleggende eksperimentene forskerne utføre…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av den russiske Stiftelsen for grunnleggende forskning, tilskudd nummer 18-29-07002. P.K. ble støttet av State Assignment of Ministry of Science and Higher Education i Russland, gi nummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. ble støttet av Departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland, tilskudd nummer 075-15-2019-1659 (Program for Kurchatov Center of Genome Research). Arbeidet ble delvis gjort på utstyret kjøpt i rammen av Moskva State University Program of Development. I.C., S.L., og M.V.B. ble i tillegg støttet av Moscow State University stipend “Leading Scientific School Noah’s Ark”.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |