Mærkning og visualisering af mitokondriegenomudtryksprodukter i Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Bakers gær mitokondrie genom koder otte polypeptider. Målet med den aktuelle protokol er at mærke dem alle og efterfølgende visualisere dem som separate bånd.

Abstract

Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der er i stand til aerobt åndedræt. De indeholder cirkulært genom og genekspressionsapparat. Et mitokondriegenom af bagergær koder otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med den her beskrevne metode er specifikt at mærke disse proteiner med ³⁵S methionin, adskille dem ved elektroforese og visualisere signalerne som diskrete bånd på skærmen. Proceduren omfatter flere trin. For det første dyrkes gærceller i et galactoseholdigt medium, indtil de når den sene logaritmiske vækstfase. Dernæst blokerer cykloheximidbehandling cytoplasmisk oversættelse og tillader kun ³⁵S methionininkorporering i mitokondrieoversættelsesprodukter. Derefter udvindes alle proteiner fra gærceller og adskilles af polyacrylamidgelelektrophoresis. Endelig tørres gelen og inkuberes med opbevaringsfosforskærmen. Skærmen scannes på en fosformager, der afslører båndene. Metoden kan anvendes til at sammenligne biosyntesehastigheden af en enkelt polypeptid i mitokondrier af en mutant gærstamme i forhold til den vilde type, hvilket er nyttigt til at studere mitokondrie genekspressionsdefekter. Denne protokol giver værdifulde oplysninger om oversættelseshastigheden for alle gær mitokondrie mRNA’er. Det kræver dog flere kontroller og yderligere eksperimenter at drage ordentlige konklusioner.

Introduction

Mitokondrier er organellerne dybt involveret i metabolismen af en eukaryote celle. Deres elektronoverførselskæde forsyner cellen med ATP, den vigtigste energiske valuta, der bruges i flere biokemiske veje. Desuden er de involveret i apoptose, fedtsyre og hemesyntese og andre processer. Dysfunktion af mitokondrier er en velkendt kilde til menneskelig sygdom¹. Det kan skyldes mutationer i nukleare eller mitokondriegener, der kodper strukturelle eller regulerende komponenter i organellerne². Baker’s gær Saccharomyces cerevisiae er en fremragende model organisme til at studere mitokondrie genekspression på grund af flere grunde. For det første er deres genom helt sekventeret³, godt kommenteret, og en stor sum data er allerede tilgængelig i litteraturen takket være den lange historie med undersøgelser udført med denne organisme. For det andet er manipulationerne med deres nukleare genom relativt hurtige og lette på grund af deres hurtige vækstrate og yderst effektive homologe rekombinationssystem. For det tredje er bagergær S. cerevisiae en af de få organismer, for hvilke manipulationerne med mitokondriegenomer udvikles. Endelig bagergær er en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillader isolering og undersøgelse af respiratoriske defekte mutanter, da de kan vokse i medier, der indeholder fermenterbare kulstofkilder.

Vi beskriver metoden til at studere mitokondrie genekspression af bagergær S. cerevisiae på oversættelsesniveau⁴. Hovedprincippet kommer fra flere bemærkninger. For det første koder gæren mitokondriegenom kun otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p⁵. Dette tal er lille, og alle af dem kan adskilles ved elektroforese på en enkelt gel under passende forhold. For det andet tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryote klasse snarere end eukaryote⁶, og derfor er følsomheden over for antibiotika anderledes for gærcytoplasmiske og mitokondrie ribosomer. Det gør det muligt at hæmme cytoplasmisk oversættelse med cykloheximid, hvilket giver betingelserne, når den mærkede aminosyre (³⁵S-methionin) kun er indarbejdet i mitokondrieoversættelsesprodukter. Som følge heraf giver eksperimentet oplysninger om hastigheden af aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetiseret de novo, hvilket afspejler den samlede effektivitet af mitokondrieoversættelse for hvert af de otte produkter.

Protocol

1. Gær kultur forberedelse Streak gær fra den frosne bestand kulturer på friske plader med passende medium. Sæt pladerne i en dyrkningsinkubator ved 30 °C i 24-48 timer.BEMÆRK: Lad de temperaturfølsomme mutanter vokse ved den eftergivende temperatur. Pod gærkulturer i 2 mL YPGal medium (2% peptone, 1% gærekstrakt, 2% galactose) fra den friske stribe i 15 mL rør og inkuber dem natten over agiterende ved 200 rpm ved 30 °C. Den optiske tæthed af kulturen måles ved en bølgelæn…

Representative Results

Efter den ovenfor beskrevne protokol tildelte vi mitokondrieoversættelsesprodukter fra to S. cerevisiaestammer: den vilde type (WT) og en mutantbærende sletning af AIM23-genet (AIM23Δ), kodning af mitokondrieoversættelsesstartfaktor 3 (tabel 1)8. Mitokondrieoversættelsesprodukter blev radioaktivt mærket og adskilt i SDS-PAAG9. Prøverne blev indsamlet hver 2,5 min før mætning for at opbygge et tidsforløb(Figur 1A</s…

Discussion

Undersøgelser af genekspression indtager en central rolle i moderne biovidenskab. Der er udviklet en lang række metoder, der giver indsigt i denne komplekse proces. Her beskrev vi den metode, der giver adgang til proteinbiosyntese i bagergær S. cerevisiae mitokondrier. Det er normalt anvendes til at sammenligne oversættelse effektivitetsgevinster af mRNA’er i mitokondrier af mutant gær stamme versus vilde type for at få adgang til konsekvenserne af den undersøgte mutation. Dette er et af de grundlæggende…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625