Använda Immunofluorescence för att upptäcka PM2.5-induceradDNA-skada i Zebrafish Embryo Hearts
Summary
Detta protokoll använder en immunofluorescensanalys för att upptäcka PM2,5-induceradDNA-skada i de dissekerade hjärtana hos zebrafiskembryon.
Abstract
Omgivande fina partiklar (PM2,5) exponering kan leda till hjärt utvecklingstoxicitet men de underliggande molekylära mekanismerna är fortfarande oklart. 8-hydroxy-2’deoxygenas (8-OHdG) är en markör för oxidativ DNA-skada och γH2AX är en känslig markör för DNA dubbelsträngsbrott. I denna studie syftade vi till att upptäcka PM2,5-inducerad8-OHdG och γH2AX förändringar i hjärtat av zebrafiskembryon med hjälp av en immunofluorescensanalys. Zebrafiskembryon behandlades med extrakterbara organiska ämnen (EOM)från PM 2, 5 vid 5 μg/ml i närvaro eller frånvaro av antioxidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0, 25 μM) vid 2 h efter befruktning (hpf). DMSO användes som fordonskontroll. Vid 72 hpf dissekerades hjärtan från embryon med hjälp av en spruta nål och fasta och permeabilized. Efter att ha blockerats undersöktes prover med primära antikroppar mot 8-OHdG och γH2AX. Prover tvättades och inkuberades sedan med sekundära antikroppar. De resulterande bilderna observerades under fluorescensmikroskopi och kvantifierades med ImageJ. Resultaten visar att EOM från PM2,5 avsevärt förbättrade 8-OHdG- och γH2AX-signaler i hjärtat av zebrafiskembryon. NAC, som fungerar som en reaktiv syreart (ROS) asätare, motverkade dock delvis den EOM-inducerade DNA-skadan. Här presenterar vi ett immunofluorescensprotokoll för att undersöka DNA-skadans roll i PM2,5-induceradehjärtfel som kan tillämpas på detektion av miljömässiga kemiskt inducerade proteinuttrycksförändringar i hjärtat på zebrafiskembryon.
Introduction
Luftföroreningar är nu ett allvarligt miljöproblem som världen står inför. Omgivande fina partiklar (PM2.5), som är en av de viktigaste indikatorerna på luftkvalitet, kan bära ett stort antal skadliga ämnen och komma in i blodcirkulationssystemet, vilket orsakar allvarlig skada på människors hälsa1. Epidemiologiska studier har visat att PM2, 5 exponering kan leda till en ökad risk för medfödda hjärtfel (CHDs)2,3. Bevis från djurförsök visade också att PM2,5 kan orsaka onormal hjärtutveckling hos zebrafiskembryon och avkomman till möss men de molekylära mekanismerna i hjärtutvecklingstoxiciteten hos PM2,5 är fortfarande till stor delokänd 4,5,6.
DNA-skador kan orsaka cellcykelstopp och inducera apoptos, vilket i stor utsträckning kan förstöra potentialen hos stamceller och därmed försämra hjärtutvecklingen7). Det har väl dokumenterats att miljöföroreningar, inklusive PM2,5, har potential att attackera DNA genom oxidativastressmekanismer 8,9. Både mänskliga och zebrafisk hjärt utveckling är känsliga för oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG är en oxidativ DNA-skademarkör, och γH2AX-signal är en markör för DNA-dubbla strandbrott. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk föregångare till intracellulär cystein och glutation, används ofta som en antioxidantförening. I denna studie använder vi NAC för att undersöka oxidativ stress i PM2.5– inducerad DNA-skada13.
Zebrafisk som modell ryggradsdjur har använts i stor utsträckning för att studera hjärtutveckling och mänskliga hjärt-kärlsjukdomar eftersom mekanismer för hjärtutveckling är mycket bevarade bland ryggradsdjur14,15. Fördelarna med att använda zebrafisk som modell inkluderar deras lilla storlek, starka reproduktiva förmåga och låga utfodringskostnader. Av särskilt intresse för dessa studier är zebrafiskembryon inte beroende av cirkulationssystemet under tidig utveckling och kan överleva allvarlig hjärtmissbildning14. Dessutom gör deras transparens att hela kroppen kan observeras direkt under ett mikroskop. Zebrafiskembryon ger således en enastående möjlighet att bedöma de molekylära mekanismer som är involverade i induktion av hjärtutvecklingstoxicitet till följd av exponering för olikamiljökemikalier 5,16,17. Vi har tidigare rapporterat att PM2,5-induceradoxidativ stress leder till DNA-skador och apoptos, vilket resulterar i hjärtmissbildningar i zebrafisk18. I denna studie tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att undersöka PM2,5-induceradDNA-skada i hjärtat av zebrafiskembryon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om zebrafisk är en utmärkt ryggradsdjursmodell för att studera miljökemikaliernas hjärtutvecklingstoxicitet, på grund av embryohjärtats lilla storlek, är det svårt att få tillräckligt med protein för västerländsk fläckanalys. Därför presenterar vi en känslig immunofluorescensmetod för kvantifiering av proteinuttrycksnivåerna för DNA-skador biomarkörer i hjärtat på zebrafiskembryon som utsätts för PM2,5.
Under dissekering är det viktigt att hålla hj?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Nature Sciences Foundation of China (Anslagsnummer: 81870239, 81741005, 81972999) och Den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Lärosäten.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
Referências
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
