تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة
Summary
تم تطوير طريقة مكررة لإزالة الأنسجة وتطبيقها على قلب الماوس البالغ. تم تصميم هذه الطريقة لمسح كثيفة، والأنسجة القلبية autofluorescent، مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية المسمى يعزى إلى استراتيجية مراسل الجينية.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر انتشارا للوفيات في جميع أنحاء العالم وغالبا ما تتميز بزيادة تليف القلب التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة تصلب البطين مع تغيير وظيفة القلب. هذه الزيادة في التليف البطيني القلبي يرجع إلى تنشيط الخلايا الليفية المقيمة ، على الرغم من أن كيفية عمل هذه الخلايا داخل القلب ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) ، عند خط الأساس أو بعد التنشيط ، ليست مفهومة جيدا. لدراسة كيفية مساهمة الخلايا الليفية في أمراض القلب وديناميكياتها في القلب ثلاثي الأبعاد ، تم تطوير طريقة منقحة لإزالة الأنسجة والتصوير المستندة إلى CLARITY تظهر الخلايا الليفية القلبية المسماة بالفلورسنت داخل قلب الماوس بأكمله. تم تسمية الخلايا الليفية المقيمة في الأنسجة وراثيا باستخدام فئران المراسلة الفلورية Rosa26-loxP-eGFP المتقاطعة مع الأرومة الليفية القلبية التي تعبر عن خط طرق Tcf21-MerCreMer. وقد استخدمت هذه التقنية لمراقبة ديناميات توطين الخلايا الليفية في جميع أنحاء البطين الأيسر البالغ بأكمله في الفئران السليمة وفي نماذج الماوس الليفي لأمراض القلب. ومن المثير للاهتمام، في نموذج إصابة واحدة، لوحظت أنماط فريدة من الخلايا الليفية القلبية في قلب الفأر المصاب الذي تبع عصابات من الألياف الملفوفة في اتجاه الانكماش. وفي نماذج الإصابات الإقفارية، حدثت وفاة في الخلايا الليفية، أعقبها إعادة السكان من المنطقة الحدودية المحتشدة. بشكل جماعي ، تسمح تقنية توضيح الأنسجة القلبية المكررة ونظام التصوير الرقمي بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الليفية القلبية في القلب دون قيود فشل اختراق الأجسام المضادة أو القضايا السابقة المحيطة بالفلورسينس المفقود بسبب معالجة الأنسجة.
Introduction
على الرغم من أن خلايا القلب تشكل أكبر جزء حجم في القلب ، إلا أن الخلايا الليفية القلبية أكثر وفرة وتشارك بشكل حاسم في تنظيم السمات الهيكلية والتجزية الأساسية لهذا الجهاز. الخلايا الليفية القلبية هي متحركة للغاية، واستجابة ميكانيكيا، وتتراوح phenotypically اعتمادا على مدى تفعيلها. الخلايا الليفية القلبية ضرورية للحفاظ على المستويات الطبيعية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وإنتاج ECM قليل جدا أو أكثر من اللازم من قبل هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى المرض1،2،3. ونظرا لأهميتها في المرض ، أصبحت الخلايا الليفية القلبية موضوعا متزايد الأهمية للتحقيق نحو تحديد استراتيجيات العلاج الجديدة ، خاصة في محاولة للحد من التليف المفرط4و5و6و7. عند الإصابة ، تنشط الخلايا الليفية وتفرق إلى نوع خلية اصطناعية أكثر تعرف باسم الورم العضلي ، والتي يمكن أن تكون منتشرة وتفرز ECM وفيرة ، وكذلك نشاط انقباش يساعد على إعادة تشكيل البطينين.
في حين تم تقييم الخلايا الليفية القلبية على نطاق واسع لخصائصها في الثقافات ثنائية الأبعاد6و8و9و10، إلا أنه أقل بكثير من فهم خصائصها وديناميكياتها في القلب الحي ثلاثي الأبعاد ، إما عند خط الأساس أو مع تحفيز المرض. هنا ، وقد وصفت طريقة المكرر لمسح الأنسجة قلب الماوس الكبار مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية وصفت مع Rosa26 – loxP – eGFP x Tcf21 – MerCreMer نظام المراسل الجيني. داخل القلب، Tcf21 هو علامة محددة نسبيا من الخلايا الليفية هادئة4. بعد إعطاء تاموكسيفين لتنشيط بروتين MerCreMer غير القابل للانزدواج ، فإن جميع الخلايا الليفية هادئة ستعبر بشكل دائم عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) من مكان Rosa26 ، والذي يسمح بتتبعها في الجسم الحي.
توجد العديد من بروتوكولات تطهير الأنسجة الراسخة ، وبعضها تم تطبيقه على القلب11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك، تم العثور على العديد من الكواشف المستخدمة في بروتوكولات مختلفة لإزالة الأنسجة لإرواء إشارات الفلورة الذاتية18. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب مسح قلب البالغين بسبب البروتينات الوفيرة التي تحتوي على مجموعة الهيم التي تولد autofluorescence19. لذلك ، كان الهدف من هذا البروتوكول هو الحفاظ على مضان علامة الورم الليفي مع تثبيط متزامن للفلورة الذاتية للهيم في قلب البالغين المصابين للحصول على التصور الأمثل ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي12و13و14و16و17و20.
الدراسات السابقة في محاولة لفحص الورم الليفي القلب في الجسم الحي تستخدم الأجسام المضادة التي غرست لتسمية هذه الخلايا، على الرغم من أن هذه الدراسات كانت محدودة من قبل اختراق الأجسام المضادة وهيكل الأوعية الدمويةالقلبية 14،16،17،20. على الرغم من أن Salamon وآخرون قد أظهرت تطهير الأنسجة مع الحفاظ على مضان الخلايا العصبية الموضعية في قلب الوليد، وNehrhoff وآخرون أظهرت الحفاظ على الفلورية بمناسبة الخلايا النخاعية، والحفاظ على الفلورية الذاتية من خلال الجدار البطيني بأكمله لم يثبت بعد، بما في ذلك تصور الخلايا الليفية القلب الكبار في خط الأساس أو بعدالإصابة 13،20. هذا البروتوكول تطهير الأنسجة يصقل خليط من البروتوكولات السابقة على أساس طريقة وضوح (واضح تبادل الدهون الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة / في الموقع التهجين الأنسجة المتوافقة مع الهيدروجيل) وPEGASOS (البولي ايثيلين غليكول (PEG) المرتبطة نظام المذيبات). سمح هذا البروتوكول المكرر بفحص أقوى للخلايا الليفية القلبية في قلب الماوس عند خط الأساس وكيفية استجابتها لأنواع مختلفة من الإصابات. البروتوكول واضح وقابل للاستنساخ وسيساعد على توصيف سلوك الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه المقالة طريقة مكررة لتطهير الأنسجة التي تسمح بتصور الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي ، سواء عند خط الأساس أو بعد الإصابة ، لتوصيف وفهم الخلايا الليفية بشكل أفضل في قلب الماوس. يعالج هذا البروتوكول المعزز القيود في بروتوكولات إزالة الأنسجة الموجودة التي حاولت تحديد أنواع خلا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بجوهر التصوير Confocal CCHMC لمساعدتهم وتوجيههم في تطوير هذا النموذج ، وكذلك مات باتي من الهندسة السريرية لتصميم جميع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. تم دعم ديميتريا فيشيسر بمنحة تدريبية من المعاهد الوطنية للصحة ، (NHLBI ، T32 HL125204) وجيفري د. مولكينتين بدعم من معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
Referências
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
